一种复制可控型流感病毒的检测方法与流程

本发明涉及流感病毒技术领域，具体涉及一种复制可控型流感病毒的检测方法。

背景技术：

流行性感冒(流感)是由流感病毒(influenzavirus)导致的呼吸道和其他脏器的疾病，在健康儿童和成人中，每年均会在春冬季，甚至其它季节有不同程度的流行，通常是一种急性、传染性的疾病。

流感病毒是导致流感的病原体，属于负链单股rna病毒，其基因组共有8个独立的rna片段(分别以片段1-8命名)组成，核酸总长度约为13.6kb。这8个片段共编码10种蛋白质，其中8种为结构蛋白，包括pb1、pb2、pa、ha、na、np、m1、m2,而ns1、ns2为非结构蛋白。流感病毒分为人流感病毒和动物流感病毒，人流感病毒分为甲(a)、乙(b)、丙(c)三型。

病毒复制主要依靠病毒核糖核蛋白(vrnps)。甲型流感病毒的核糖核蛋白由病毒rna、rna聚合酶(rdrp)复合体以及核蛋白(np)组成，是病毒的最小复制单位，病毒蛋白在该结构基础上才能表达。vrnps结构中的rdrp由3个亚基(pa、pb2、pb1)组成，pb1位于三聚体的核心，其n末端和c末端分别与pa亚基的c末端以及pb2亚基的n末端通过非共价键(如疏水作用、氢键、范德华力等)形成稳定的蛋白质复合物。

尽管治疗流感病毒可以使用各类抗病毒药物，但由于流感病毒快速变异，世界各地每年有流感的散发流行和暴发，正确接种流感疫苗可以有效的减少流感发病率。

目前，流感疫苗按照其种类可分为：全病毒灭活疫苗、裂解疫苗和亚单位疫苗。全病毒灭活疫苗、裂解疫苗，因流感快速变异，需要每年在爆发季节前，对当年可能爆发的毒株进行预测，准确预测有一定难度，预测错误，将导致疫苗保护率大幅度下降，而且，即便准确预测，也因为目前主要采用的鸡胚生产工艺，病毒产生的鸡胚适应性变异，导致疫苗保护效率不高；对于亚单位疫苗，由于目前并没有发现流感病毒可以用于疫苗的保守序列，导致进展缓慢。

因此，迫切需要更具有安全性并更好的保留全病毒免疫活性的流感疫苗及其生产方法的问世。在此基础上，也需要一种专门针对复制可控型流感病毒的检测方法，实现在疫苗生产以及疫苗使用过程中流感病毒有效性和安全性的控制。

技术实现要素：

本发明的目的在于通过特定哺乳动物细胞生产流感病毒，以用于疫苗制备，并通过特定检测方法实现对所述流感病毒的检测。所述流感病毒由于引入突变而不能在正常哺乳动物细胞中增殖，只能在整合了外源病毒蛋白基因的宿主细胞中增殖。

为达到上述目的，本发明向哺乳动物细胞中转入特定的基因，获得稳定表达相应的流感病毒蛋白的宿主细胞，再转染相关基因突变后的流感病毒拯救系统，拯救获得复制可控的新型流感活病毒。为实现该类特殊病毒的检测，本发明利用qpcr方法针对所述病毒基因组的特点设计相应引物，以实现快速准确的检测。

具体而言，本发明提供如下技术方案：

首先，本发明提供一种复制可控型流感病毒的定量检测方法，将待测病毒液与生产用细胞共培养，随后提取总rna并逆转录为cdna，最后根据已知拷贝数的野生型病毒qpcr的ct值结果绘制标准曲线，代入复制可控型流感病毒的ct值，计算获得流感病毒拷贝数优选的，野生型病毒为流感病毒h1n1的a/wsn/1933株，且检测野生型病毒和复制可控型流感病毒的qpcr引物均为下列引物:

ben3-fp：5’-caaatgtccaaagaagtaaatgctaga-3’(seqidno:23)

ben3-rp：5’-ggcatccatcagcaggaatt-3’(seqidno:24)。

在一个优选方案中，所述检测方法包括如下步骤：

(1)用dmem+10％fbs培养基于37℃，5％co2静置培养293t细胞或vero细胞24小时；

(2)加入待测病毒液并于37℃，5％co2静置孵育2小时；

(3)trnzol法提取rna；

(4)将rna反转录为cdna

(5)通过qpcr反应体系测量待测样品的ct值，根据已知拷贝数的野生型病毒作为标准品进行qpcr并绘制标准曲线，将待测样品的ct值带入回归曲线并获得相应拷贝数；

所述ct值为每个反应管内的荧光信号到达设定值时所经历的循环数。

优选的，步骤(4)按如下方案进行：

(i)配制含有随机引物和寡核苷酸引物以及待测rna的反应体系1，以及含有mgcl2、缓冲液、dntp、重组rna酶抑制剂以及amv逆转录酶的反应体系2；

(ii)将反应体系1离心于管底，在常规pcr仪上70℃孵育5min，完成后立即置于冰上3min；

(iii)将反应体系2加入到反应体系1中，25℃孵育5min，42℃孵育50min，70℃孵育15min，4℃备用。

本发明的病毒检测方法优选适用于按照本发明的特定方法获得的复制可控型流感病毒。具体而言，所述病毒具有如下特点：通过将病毒拯救系统导入哺乳动物宿主细胞的方式获得，所述哺乳动物宿主细胞稳定整合流感病毒pa、pb1、pb2和np基因，流感病毒拯救系统中携带突变型pa、pb1、pb2和np基因，所述突变使得流感病毒拯救系统不能在天然哺乳动物细胞中拯救获得完整病毒。

优选的，所述流感病毒拯救系统包括编码突变型pa、pb1、pb2和np基因的重组质粒以及编码ha、na、m、ns四种基因的重组质粒，所述突变通过分别在四个基因序列中引入tag密码子实现。

更优选的，所述所述稳定整合到宿主细胞的pa、pb1、pb2和np基因以及流感病毒拯救系统中的病毒编码基因ha、na、m、ns均来自流感病毒h1n1的a/wsn/1933株。

尤其优选的，所述所述稳定整合到宿主细胞的pa、pb1、pb2和np基因的核苷酸序列分别为如seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3和seqidno:4所示。

最为优选的，所述流感病毒拯救系统包括如下八个质粒：ppoli-wsn-pb、ppoli-wsn-pb1、ppoli-wsn-pa、ppoli-wsn-np、ppoli-wsn-ha；ppoli-wsn-na；ppoli-wsn-m；ppoli-wsn-ns，其中，所含有的pa基因存在r266密码子突变为tag、pb1基因存在r52密码子突变为tag)、pb2基因存在k33密码子突变为tag和np基因存在d101密码子突变为tag。

以下对相关术语进行进一步解释。

病毒拯救

病毒拯救或称病毒的感染性分子克隆属于反向遗传操作技术，即通过人工操作基因，用病毒核酸的适当形式在一定条件下转染细胞，产生有感染性的病毒粒子。本发明可选的使用hoffmann等建立的8质粒拯救系统，完全以质粒为基础的系统其优点是不需要辅助病毒，避免了大量的筛选工作。8质粒系统以数量最少的质粒为基础，利用同一载体实现在细胞内的病毒rna和蛋白合成，进而包装成病毒。

在本发明中，病毒拯救获得病毒颗粒可按如下方法进行：

(1)构建编码pa、pb1、pb2和np基因的单质粒或多质粒系统；

(2)将步骤(1)的单质粒或多质粒系统导入哺乳动物细胞，筛选稳定表达四种基因的宿主细胞，优选地，通过电转化导入；

(3)分别构建包含突变型pa、pb1、pb2和np基因的重组质粒以及编码ha、na、m、ns四种基因的重组质粒，形成流感病毒拯救系统，所述突变通过分别在四个基因序列中引入tag密码子实现；

(4)将步骤(3)构建的病毒拯救系统共转染导入步骤(2)的宿主细胞；

(5)培养步骤(4)获得的细胞并收获流感病毒的颗粒。

优选的，步骤(1)中所述pa、pb1、pb2和np基因的核苷酸序列分别如seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3和seqidno:4所示。

优选的，所述流感病毒拯救系统包括如下八个质粒：ppoli-m-pb2、ppoli-m-pb1、ppoli-m-pa、ppoli-m-np、ppoli-wsn-ha；ppoli-wsn-na；ppoli-wsn-m；ppoli-wsn-ns，其中，所含有的pa基因存在r266密码子突变为tag、pb1基因存在r52密码子突变为tag、pb2基因存在k33密码子突变为tag和np基因存在d101密码子突变为tag。

流感病毒株

在本发明中，涉及的基因片段来源于a型流感病毒或b型流感病毒，优选来源于a型h1n1(如a/wsn/1933，a/pr/8)，h3n2(如a/aichi/2/68)毒株。

作为一个优选的具体实施方案，本发明使用来自h1n1的a/wsn/1933的流感病毒株作为所有基因片段的克隆来源。

许多生物体对具体密码子的使用显示出偏好，因此可基于密码子优化就给定生物体中最佳的基因表达来调节基因。本发明发现编码病毒蛋白的基因序列存在不同宿主细胞之间的密码子偏好性，并且所述偏好性直接影响了蛋白表达量，并决定了病毒拯救的效率。在一个优选方案中，发明人通过反复试验获得了具有较高外源蛋白表达量，且病毒拯救效率较高的优化密码子，基于密码子优化结果：所述pa基因序列如seqidno:1所示；所述pb1基因序列如seqidno:2所示；所述pb2基因序列如seqidno:3所示；所述np基因序列如seqidno:4所示。

seqidno:1如下：

atggaggacttcgtgaggcagtgcttcaaccccatgatcgtggagctggccgagaaggccatgaaggagtacggcgaggacctgaagatcgagaccaacaagttcgccgccatctgcacacacctggaggtgtgcttcatgtactctgacttccacttcatcgacgagcagggcgagtccatcgtggtggagctgggggaccccaacgctctgctgaagcaccggttcgagatcatcgagggacgggacaggaccatcgcctggacagtgatcaacagcatctgcaacaccacaggggccgagaagcccaagttcctgcccgacctgtacgactacaagaagaacaggttcatcgagatcggcgtgaccaggagagaggtgcacatctactacctggagaaggccaacaagatcaagtccgagaagacccacatccacatcttcagcttcacaggggaggagatggccaccaaggccgactacacactggacgaggagagcagggcccggatcaagaccaggctgttcacaatcagacaggagatggcctccaggggcctgtgggactccttccggcagagcgagaggggagaggagacaatcgaggagagattcgagatcaccggcacaatgagaaagctggccgaccagtccctgccacccaacttcagctctctggagaagttcagagcctacgtggacgggttcgagcccaacggctacatcgaggggaagctgagccagatgtctaaggaggtgaacgccagaatcgagcccttcctgaagagcacccccaggcccctgagactgccagacggaccaccatgctcccagcggagcaagttcctgctgatggacgccctgaagctgtccatcgaggaccccagccacgagggagagggcatccccctgtacgacgccatcaagtgcatgagaacattcttcggctggaaggagcccaacgtggtgaagccccacgagaaggggatcaaccccaactacctgctgagctggaagcaggtgctggccgagctgcaggacatcgagaacgaggagaagatcccccggaccaagaacatgaagaagacatctcagctgaagtgggctctgggagagaacatggctccagagaaggtggacttcgacgactgcaaggacgtgggggacctgaagcagtacgacagcgacgagcccgagctgaggtctctggcctcctggattcagaacgagttcaacaaggcctgcgagctgaccgactccagctggatcgagctggacgagatcggagaggacgctgctcccatcgagcacatcgccagcatgcggaggaactacttcaccgccgaggtgtctcactgcagggccacagagtacatcatgaagggcgtgtacatcaacacagccctgctgaacgcctcctgcgctgctatggacgacttccagctgatccccatgatcagcaagtgcagaaccaaggaggggagacggaagacaaacctgtacggcttcatcatcaagggcaggagccacctgcggaacgacaccgacgtggtgaacttcgtgtctatggagttctccctgacagacccccggctggagccacacaagtgggagaagtactgcgtgctggaggtcggcgacatgctgctgaggtctgccatcgggcacgtgtcccggcccatgttcctgtacgtgaggaccaacggcacaagcaagatcaagatgaagtgggggatggagatgaggagatgcctgctgcagagcctgcagcagatcgagtctatgatcgaggccgagtcttccgtgaaggagaaggacatgaccaaggagttcttcgagaacaagtccgagacatggccagtgggagagagcccaaagggagtggaggagggctctatcgggaaggtgtgccggaccctgctggccaagagcgtgttcaactctctgtacgcctccccacagctggagggcttcagcgccgagtctaggaagctgctgctgatcgtgcaggccctgagagacaacctggagccagggaccttcgacctgggagggctgtacgaggccatcgaggagtgcctgatcaacgacccctgggtgctgctgaacgccagctggttcaactctttcctgacacacgccctgagatga

seqidno:2如下：

atggacgtgaaccccacactgctgttcctgaaggtgcccgcccagaacgccatctccaccacattcccctacaccggcgaccccccatacagccacggaaccgggacaggctacaccatggacacagtgaacaggacacaccagtactctgagagagggcggtggaccacaaacaccgagacaggagctccacagctgaaccccatcgacggaccactgccagaggacaacgagccatccggatacgctcagaccgactgcgtgctggaggccatggccttcctggaggagagccaccccgggatcttcgagacctcttgcctggagacaatggaggtggtgcagcagacccgggtggacaagctgacacagggcaggcagacctacgactggacactgaacagaaaccagccagctgctaccgccctggccaacacaatcgaggtgttcagatccaacggactgaccgctaacgagagcggccggctgatcgacttcctgaaggacgtgatggagtctatgaacaaggaggagatggagatcaccacacacttccagagaaagaggagagtgcgggacaacatgacaaagaagatggtgacccagagaacaatcggcaagagaaagcagcggctgaacaagaggagctacctgatcagagccctgaccctgaacaccatgacaaaggacgctgagagagggaagctgaagagaagggccatcgccaccccagggatgcagatcaggggcttcgtgtacttcgtggagacactggccaggagcatctgcgagaagctggagcagtccggactgccagtgggagggaacgagaagaaggccaagctggccaacgtggtgcggaagatgatgaccaactctcaggacacagagatcagcttcaccatcacaggggacaacacaaagtggaacgagaaccagaaccccaggatgttcctggccatgatcacctacatcacacggaaccagcccgagtggttcaggaacgtgctgtccatcgcccccatcatgttcagcaacaagatggccagactggggaagggctacatgttcgagtctaagtccatgaagatcagaacccagatcccagctgagatgctggccagcatcgacctgaagtacttcaacgactctaccagaaagaagatcgagaagatcagaccactgctgatcgacggaacagccagcctgtctcccgggatgatgatgggcatgttcaacatgctgagcaccgtgctgggggtgtctatcctgaacctgggccagaagaggcacacaaagaccacatactggtgggacggcctgcagagctctgacgacttcgccctgatcgtgaacgctccaaaccacgagggcatccaggctggcgtgaacaggttctacagaacatgcaagctgctggggatcaacatgagcaagaagaagagctacatcaaccggaccggcacattcgagttcacctctttcttctaccgatacgggttcgtggccaacttctccatggagctgccctctttcggggtgtccggcatcaacgagagcgccgacatgtctatcggcgtgaccgtgatcaagaacaacatgatcaacaacgacctgggaccagctacagctcagatggccctgcagctgttcatcaaggactacaggtacacctaccggtgccacaggggcgacacccagatccagacaagacggagcttcgagatcaagaagctgtgggagcagacccactctaaggctggactgctggtgtccgacggaggacccaacctgtacaacatcaggaacctgcacatccccgaggtgtgcctgaagtgggagctgatggacgaggactaccagggcagactgtgcaaccccctgaaccccttcgtgaaccacaaggacatcgagtccgtgaacaacgccgtgatcatgccagctcacggaccagctaagaacatggagtacgacgccgtggccaccacacacagctggattcccaagaggaacagatccatcctgaacaccagccagaggggcatcctggaggacgagcagatgtaccagaagtgctgcaacctgttcgagaagttcttcccctccagctcttacaggagacccgtgggcatctccagcatggtggaggctatggtgagccgggccaggatcgacgccaggatcgacttcgagtctgggagaatcaagaaggaggagttcaccgagatcatgaaaatctgcagcacaatcgaggagctgcggaggcagaagtga

seqidno:3如下：

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seqidno:4如下：

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需要强调的是，本发明在提到pa、pb1、pb2和np基因时，如无特别限定，指的是可以编码pa、pb1、pb2和np蛋白的任何核苷酸序列，包括进行了密码子偏好人工改造的核苷酸序列。q_pa、q_pb1、q_pb2、q_np基因特指根据vero细胞偏好进行改造后的核苷酸序列。突变型pa、pb1、pb2和np基因是指对病毒拯救系统中的四个基因进行了引入终止密码子的定点突变所获得的核苷酸序列。

宿主细胞

本发明用于表达病毒蛋白的原始宿主细胞可以选自vero细胞、mdck细胞，293细胞，mrc5等细胞。不同宿主细胞在拯救流感病毒的效力方面存在差别，优选为vero细胞、mdck细胞，因为使用这两种细胞的拯救效率高于其余细胞2倍以上(以拯救后的病毒滴度计算)。

载体

本发明用于向哺乳动物细胞导入pa、pb1、pb2和np基因的载体可以选自各种常规的蛋白表达质粒，优选pbudce4.1。为表达上述基因，本发明构建了同时表达上述四个基因的一个重组质粒。作为备选的技术方案，本发明构建了表达上述四个基因的双质粒系统、三质粒系统和四质粒系统，其中每个质粒可以表达上述四个基因中的一个或多个。根据实验验证，上述四种系统均能实现目标蛋白的稳定表达。作为优选的方案，本发明使用pbudce4.1，因为在该质粒上实现了同时表达所述四种外源基因，具有相对较高的转染效率，并获得了相对其他载体更高的稳定整合效率。作为另一种实现较高转染和整合效率的可选的方案，本发明也使用双质粒系统。所谓双质粒系统优选是以pcdna3.1/hygro(+)为骨架，构建同时表达pa和pb1蛋白的pcdna3.1_pa_pb1载体；以pbudce4.1为骨架，构建同时表达np和pb2蛋白的pbudce4.1_puro_np_pb2载体。在构建稳定细胞株时，同时将该双质粒转入宿主细胞中。

pbudce4.1的核苷酸序列(seqidno:5)如下：

gcgcgcgttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggactatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctctctggctaactagagaacccactgcttactggcttatcgaaattaatacgactcactatagggagacccaagcttgcattcctgcaggtcgacatcgatcttaagcagtacttctagaggatccgaacaaaaactcatctcagaagaggatctgaatatgcataccggtcatcatcaccatcaccattgagtttgatccccgggaattcagacatgataagatacattgatgagtttggacaaaccacaactagaatgcagtgaaaaaaatgctttatttgtgaaatttgtgatgctattgctttatttgtaaccattataagctgcaataaacaagttggggtgggcgaagaactccagcatgagatccccgcgctggaggatcatccagccggcgtcccggaaaacgattccgaagcccaacctttcatagaaggcggcggtggaatcgaaatctcgtagcacgtgtcagtcctgctcctcggccacgaagtgcacgcagttgccggccgggtcgcgcagggcgaactcccgcccccacggctgctcgccgatctcggtcatggccggcccggaggcgtcccggaagttcgtggacacgacctccgaccactcggcgtacagctcgtccaggccgcgcacccacacccaggccagggtgttgtccggcaccacctggtcctggaccgcgctgatgaacagggtcacgtcgtcccggaccacaccggcgaagtcgtcctccacgaagtcccgggagaacccgagccggtcggtccagaactcgaccgctccggcgacgtcgcgcgcggtgagcaccggaacggcactggtcaacttggccatggtttagttcctcaccttgtcgtattatactatgccgatatactatgccgatgattaattgtcaacacgtgctgatcagatccgaaaatggatatacaagctcccgggagctttttgcaaaagcctaggcctccaaaaaagcctcctcactacttctggaatagctcagaggcagaggcggcctcggcctctgcataaataaaaaaaattagtcagccatggggcggagaatgggcggaactgggcggagttaggggcgggatgggcggagttaggggcgggactatggttgctgactaattgagatgcatgctttgcatacttctgcctgctggggagcctggggactttccacacctggttgctgactaattgagatgcatgctttgcatacttctgcctgctggggagcctggggactttccacaccctcgtcgagctagcttcgtgaggctccggtgcccgtcagtgggcagagcgcacatcgcccacagtccccgagaagttggggggaggggtcggcaattgaaccggtgcctagagaaggtggcgcggggtaaactgggaaagtgatgtcgtgtactggctccgcctttttcccgagggtgggggagaaccgtatataagtgcagtagtcgccgtgaacgttctttttcgcaacgggtttgccgccagaacacaggtaagtgccgtgtgtggttcccgcgggcctggcctctttacgggttatggcccttgcgtgccttgaattacttccacctggctccagtacgtgattcttgatcccgagctggagccaggggcgggccttgcgctttaggagccccttcgcctcgtgcttgagttgaggcctggcctgggcgctggggccgccgcgtgcgaatctggtggcaccttcgcgcctgtctcgctgctttcgataagtctctagccatttaaaatttttgatgacctgctgcgacgctttttttctggcaagatagtcttgtaaatgcgggccaggatctgcacactggtatttcggtttttgggcccgcggccggcgacggggcccgtgcgtcccagcgcacatgttcggcgaggcggggcctgcgagcgcggccaccgagaatcggacgggggtagtctcaagctggccggcctgctctggtgcctggcctcgcgccgccgtgtatcgccccgccctgggcggcaaggctggcccggtcggcaccagttgcgtgagcggaaagatggccgcttcccggccctgctccagggggctcaaaatggaggacgcggcgctcgggagagcgggcgggtgagtcacccacacaaaggaaaagggcctttccgtcctcagccgtcgcttcatgtgactccacggagtaccgggcgccgtccaggcacctcgattagttctggagcttttggagtacgtcgtctttaggttggggggaggggttttatgcgatggagtttccccacactgagtgggtggagactgaagttaggccagcttggcacttgatgtaattctcgttggaatttgccctttttgagtttggatcttggttcattctcaagcctcagacagtggttcaaagtttttttcttccatttcaggtgtcgtgaacacgtggtcgcggccgcttcgaaggtaccagcacagtggactcgagagatctggccggctgggcccgtttcgaaggtaagcctatccctaaccctctcctcggtctcgattctacgcgtaccggtcatcatcaccatcaccattgagtttaaacccgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatggcttctgaggcggaaagaaccagtggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgacattaacctataaaaataggcgtatcacgaggccctttcgtctcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggctggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatatatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgccattcgccattcaggctgcgcaactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctattacgcca

定点突变

本发明对病毒拯救系统中的四个基因(pa、pb1、pb2和np)进行了引入终止密码子的定点突变，其目的是使拯救系统在上述构建的宿主细胞中，能够实现病毒拯救和感染增殖，而在正常的动物细胞中，因终止密码子的引入导致pa、pb1、pb2和np无法正常表达，从而无法病毒拯救和无法感染增殖。所述四个基因中，pa、pb1、pb2分别编码rna聚合酶复合体的3个亚基，np编码核蛋白，四个基因共同失活确保了病毒不能在正常细胞中进行复制增殖，即产生复制可控型性状。定点突变的方式包括但不限于分别在四个基因序列中引入tag密码子，从而导致表达终止。所述突变位置可以通过对所述蛋白的氨基酸序列以及晶体结构进行分析，筛选一系列最有效的突变位点。有效的突变可以是，例如：pa(r266突变为tag)、pb1(r52突变为tag)、pb2(k33突变为tag)和np(d101突变为tag)，此外，也可以额外包含ha，na，m，ns基因上的突变。

电转化细胞

本发明使用电转的方法将pa、pb1、pb2和np基因转染vero、mdck或其他细胞，实验表明，电转的方法明显优于其它方法，且vero细胞、mdck细胞最适合。

安全性及有效性

鉴定安全性-复制缺陷性的方法为细胞病变检测实验。经体内外实验证明，复制可控型流感病毒在野生型动物细胞中不能进行复制，但可以在已表达了pa、pb1、pb2和np蛋白的宿主细胞中拯救形成完整活病毒，导致细胞病变、裂解。通过细胞病变，可以获知流感病毒在不同的细胞中是否具有复制能力。病毒免疫有效性可以通过常规的动物免疫实验进行评价。实验表明，本发明的活病毒具有非常高的安全性和遗传稳定性，与灭活病毒相比具有更好的免疫效果。

本发明的创新之处在于：本发明的检测方法特别适用于特定的突变型流感病毒，所述病毒只在特定的细胞系中可以拯救和感染增殖，但在正常的动物和人体细胞中不会复制增殖。本发明提供了特别针对所述病毒设计了与野生型病毒同样的qpcr引物，并以野生型病毒的qpcr测定结果作为标准曲线的数据来源，将待测突变型病毒的qpcr测定结果回归到曲线当中计算获得病毒颗粒数，从而实现病毒的间接定量检测。实验验证表明，所述引物、宿主细胞培养条件以及qpcr反应体系的构建使得野生型和突变型病毒的检测具有较强的特异性、较好的重复性和较高的精密度，保证了突变型病毒定量检测的准确性，为病毒疫苗制备提供可靠的质控标准。

附图说明

图1为质粒pbudce4.1_np_ires_pa_pb2_ires_pb1构建图谱；

图2为拯救形成的病毒的电镜照片，透射电镜(spirit120kv)，100kv，放大15万倍；

图3为拯救产生的病毒的突变点验证测序结果，其中基因位点1-4分别对应于np、pa、pb1和pb2的相应位点，其中在同一基因位点的对比图中，上面的序列为测定的序列，下面的序列为参考序列。

图4拯救病毒转染细胞安全性对照实验，其中a1为转染正常细胞铺板过夜后，a2为转染正常细胞培养3天后的电镜图；b1为转染按照实施例1单质粒构建的细胞并铺板过夜后，b2为其培养3天后的细胞电镜图。所用病毒液利用实施例3-1的细胞参与拯救获得。

图5：ct值标准曲线，根据八个标准品的ct值测量而成。

图6：不同基因组dna的qpcr反应结果，其中a曲线代表复制可控型流感病毒cdna；b曲线代表大肠杆菌bl基因组dna；c曲线代表大肠杆菌dh5α基因组dna；d曲线代表载体pbudce4.1基因组dna。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

需要说明的是，本发明实施例的术语“包括”和“具有”以及它们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。

实验材料

本发明经密码子优化的np，pa，pb1，pb2基因序列均来自人工合成，所有序列克隆引物、筛选标记也按照本发明所公开的序列由人工合成。载体pbudce4.1(seqidno:5)由人工合成。

本实施例部分的宿主细胞使用vero细胞，来自ccl-81^tm，属于可商购的vero细胞系。

实施例1质粒pbudce4.1_np_ires_pa_pb2_ires_pb1的构建

根据pubmed公布的流感病毒a/wsn/1933(taxonomyid:382835)的基因序列，通过密码子优化，分别获得对vero细胞具有偏好性的pa、pb1、pb2和np表达基因序列，经全基因合成，将获得的基因片段分别命名为q_pa(seqidno:1)、q_pb1(seqidno:2)、q_pb2(seqidno:3)、q_np(seqidno:4)基因。

对pbudce4.1和qpuro(嘌呤霉素抗性基因，seqidno:6)进行双酶切(ecori,avrii),t4dna连接酶连接，热激法转化至大肠杆菌dh5α中，筛选，培养扩增，纯化获得pbudce4.1+puro。

对pbudce4.1+puro和q_np进行双酶切(hindiii，sali),t4dna连接酶连接，热激法转化至大肠杆菌dh5α中，筛选，培养扩增，纯化获得pbudce4.1+puro_np。

pbudce4.1+puro_np和q_pa进行双酶切(sali，bamhi),t4dna连接酶连接，构建pbudce4.1+puro_np，热激法转化至大肠杆菌dh5α中，筛选，培养扩增，纯化获得pbudce4.1+puro_np_pa。

pbudce4.1+puro_np_pa和q_pb2进行双酶切(noti，xhoi),t4dna连接酶连接，热激法转化至大肠杆菌dh5α中，筛选，培养扩增，纯化获得pbudce4.1+puro_np_pa_pb2。

pbudce4.1+puro_np_pa_pb2和q_pb1进行双酶切(xhoi,bglii),t4dna连接酶连接，热激法转化至大肠杆菌dh5α中，筛选，培养扩增，纯化获得pbudce4.1+puro_np_pa_pb2_pb1。

上述构建过程中，筛选步骤使用的固体培养基为：低钠lb固体培养基(1％蛋白胨，0.5％氯化钠，0.5％酵母提取物，1.8％琼脂糖)，25μg/ml的博莱霉素；扩增步骤使用的液体培养基为：低钠lb液体培养基(1％蛋白胨，0.5％氯化钠，0.5％酵母提取物)，25μg/ml的博莱霉素。

该质粒的构建图谱如图1所示。qpuro基因的核苷酸序列如下(seqidno:6)：

atgaccgagtacaagcccacggtgcgcctcgccacccgcgacgacgtcccccgggccgtacgcaccctcgccgccgcgttcgccgactaccccgccacgcgccacaccgtcgacccggaccgccacatcgagcgggtcaccgagctgcaagaactcttcctcacgcgcgtcgggctcgacatcggcaaggtgtgggtcgcggacgacggcgccgcggtggcggtctggaccacgccggagagcgtcgaagcgggggcggtgttcgccgagatcggcccgcgcatggccgagttgagcggttcccggctggccgcgcagcaacagatggaaggcctcctggcgccgcaccggcccaaggagcccgcgtggttcctggccaccgtcggcgtctcgcccgaccaccagggcaagggtctgggcagcgccgtcgtgctccccggagtggaggcggccgagcgcgccggggtgcccgccttcctggagacctccgcgccccgcaacctccccttctacgagcggctcggcttcaccgtcaccgccgacgtcgaggtgcccgaaggaccgcgcacctggtgcatgacccgcaagcccggtgcctag

实施例2vero细胞培养及电转化

实施例2-1单质粒vero细胞电转化：

复苏后的vero细胞，转至t25细胞培养瓶，细胞浓度为9×10⁶个/瓶，所用的细胞培养基为含有l-谷氨酰胺、非必需氨基酸、10％fbs的mem。培养的第二天，胰酶消化后，收集细胞重悬于50mlpbs，4000rpm，10min离心去上清，再重悬于0.5mloptimem(购于美国sigma公司)。fcm1∶40计数细胞，每5×10⁶个细胞中加入0.4cm电穿孔杯(electroporationcuvette)和400μloptimemi(购于美国sigma公司)。

将1μg质粒pbudce4.1+puro_np_pa_pb2_pb1通过电转化的方式转入vero细胞(1.67e+04个细胞/μg质粒)中，电转条件为：电压120v，脉冲500μs，电击次数6次，时间间隔100ms。

实施例2-2转化后的培养

电转后的细胞，取3-5个生长情况较好的细胞池，扩大培养。

vero细胞培养条件：250μg/ml潮霉素，2μg/ml嘌呤霉素，细胞培养基为含有4mmol/ll-谷氨酰胺、非必需氨基酸、20％fbs的dmem中。37℃，5％二氧化碳恒温静置培养；每2天进行换液。

实施例2-3rt-pcr

trizol提取上述培养细胞中的总rna，使用随机引物通过m-mlv反转录酶反转录为cdna，以反转录的cdna为模板pcr扩增检测目标基因的表达情况。rt-pcr结果证明了在单质粒转化的vero细胞中，有pa、pb2、pb1和np基因mrna水平的稳定表达。

实施例3突变病毒rna拯救系统的构建

根据pubmed公布的流感病毒a/wsn/1933(taxonomyid:382835)的基因序列，经全基因合成，获得该流感病毒八个基因片段的基因。流感病毒各基因序列的genebank登录号分别为，pb2：lc333182.1，pb1：lc333183.1，pa：lc333184.1，np：lc333186.1，ha：lc333185.1，na：lc333187.1，m：lc333188.1，ns：lc333189.1。然后将其分别连接在phh21(购自中国质粒载体菌种细胞基因保藏中心)载体上，获得拯救野生型流感病毒wsn的质粒。获得的质粒的命名分别为：ppoli-wsn-pb2、ppoli-wsn-pb1、ppoli-wsn-pa、ppoli-wsn-np、ppoli-wsn-ha；ppoli-wsn-na；ppoli-wsn-m；ppoli-wsn-ns。构建8质粒系统的方法是已有技术，也可参考相关专利文献构建并使用，例如可参中国专利申请201511029463.1中的构建方法。

通过生物信息学工具consurf对流感病毒a/wsn/1933各蛋白的氨基酸的保守性进行分析，并根据已被解析的流感病毒蛋白的晶体结构，选择保守、相对保守、相对不保守、不保守的氨基酸位点进行突变，最终筛选并获得分别针对pa、pb1、pb2、np的可选择突变，pa(r266密码子突变为tag)、pb1(r52密码子突变为tag)、pb2(k33密码子突变为tag)和np(d101密码子突变为tag)突变。

针对上述选定的突变位点，分别设计能够使编码所述氨基酸的密码子突变为tag的引物，具体的引物如下所示：

表1四种蛋白上被选择位点的点突变引物

以ppoli-wsn-pb2、ppoli-wsn-pb1、ppoli-wsn-pa、ppoli-wsn-np作为模板质粒，利用定点突变试剂盒(lightningsite-directedmutagenesiskits，catalog#210518)，按说明书操作将各个蛋白上被选择的位点的氨基酸密码子通过上述引物位点突变为琥珀终止密码子tag，经测序验证突变成功。所得包含突变型基因的载体分别命名为ppoli-m-pb、ppoli-m-pb1、ppoli-m-pa、ppoli-m-np。

实施例4复制可控型病毒的拯救

将实施例2-1制备的稳定表达细胞铺板：以10cm皿为例，将稳定系按照每皿1×10⁶个/ml铺板于10cm皿平板中，混匀后，放置于37℃，5％co2，培养20-24hrs至细胞汇合度20％-40％。

按照常规方法进行病毒质粒的转染以及病毒拯救，将拯救流感病毒所用的8个质粒共转染实施例2获得的转化单质粒的vero稳定细胞系。其中：携带np、pa、pb2、pb1基因的质粒采用实施例4获得的四个定点突变质粒，携带ha，na，m，ns基因的质粒采用ppoli-wsn-ha；ppoli-wsn-na；ppoli-wsn-m；ppoli-wsn-ns四个质粒。

1mlopti-mem于ep管中，加入8种质粒(每种质粒1μg)，加入转染试剂，混匀，37℃，5％co2下孵育，5.5小时换液，转染后第4天进行半量换液，转染后第6天起，每两天补液初始体积的10％，每天观察记录细胞的生长情况以及细胞病变的情况，在单质粒转化产生稳定细胞系参与的病毒拯救中，出现70％以上病变，收获病毒液。

采用磷钨酸负染色，5min，透射电镜(spirit120kv)，100kv，放大15万倍，观察，拍得单质粒转化vero细胞参与拯救获得的完整的病毒图像，如图2所示。

实施例5复制可控型病毒的突变点确认

使用rnaisoplus(takaracodeno.:9108)提取实施例4所获得的病毒(单质粒整合的vero细胞系参与拯救)全部的rna，提取后溶于13μl无rna酶dh2o中，经takaraprimescriptonesteprt-pcrkitver.2(codeno.:rr055a)进行rt-pcr，tsingkedna凝胶回收试剂盒(codeno.：ge0101-200)切胶回收上述pcr产物，溶于25μleluentbuffer，terminatorv3.1测序反应及纯化，3730测序仪测序，3730xl对数据进行收集分析。结果参见图3。四个突变点引物如下：

表2

实验结果：如图3所示，四个突变点测序结果与参考序列完全一致，没有发生回复突变。针对双质粒系统构建的宿主细胞所参与的病毒拯救，同样进行所述突变检测，结果相同。

实施例6病毒细胞病变实验确定安全性

取正常vero细胞和实施例2-1构建的细胞，按照4*10⁵每孔铺6孔板，每孔2ml培养基分别加入不同孔中，37℃，5％co2过夜培养，再加入0.5ml病毒液(实施例5制备)，混匀，37℃，5％co2，培养3天，显微镜下观察，构建的细胞因病毒复制裂解，而正常vero细胞并未裂解。参见图4。

实施例7病毒血凝检测实验测定ha

取实施例4获得的复制可控型病毒液，即实施例2-1的细胞参与拯救形成的病毒液(分别培养6天和7天)。按照“1％鸡红细胞悬液配制”sop配制红细胞悬液。加pbs，取8道加样器装好200μl带滤芯滴头，于加样槽中吸取50μlpbs加入微量板。加入待检病毒100μl。依次做二倍系列稀释。使红细胞与病毒充分混合，温孵育60min，观察红细胞凝集现象并记录结果。结果表明，培养6天和7天的病毒液分别在稀释倍数为1:8和1:4的条件下有红细胞凝集现象，表明病毒拯救成功。。

实施例8复制可控型病毒的qpcr测定方法

用293t(购自上海纪宁实业有限公司)细胞铺板，铺板培养基为dmem+10％fbs(购自上海研生实业有限公司)，铺板量每孔1×10⁶个293t细胞，每孔添加2ml培养基，6孔板放入二氧化碳培养箱中，37℃，5％co2静置培养24hrs。

将实施例5获得的病毒液配制成待测溶液，以配制2ml为例，见表3。

表3

于生物安全柜中，吸取培养18hrs的原培养基，加入配置好的2ml病毒液，并做好相应标记。37℃，5％co2静置孵育2hrs。

trnzol法提取rna：

1)孵育完成后，弃掉原培养基，加入预热的pbs，洗板3次。然后向6孔板中加入trnzol试剂，每孔0.2ml。吹吸使之变成匀浆。将其转移至离心管中，做好标记。

2)室温放置5min，使核酸蛋白复合物完全分离。

3)每孔加入0.04ml氯仿，剧烈震荡15s，室温放置3min。

4)4℃，12000g，离心15min，将上层水相转移至新管中，(不要吸到中间层以及下层)，约100μl。

5)加入等体积的-80℃预冷的异丙醇，颠倒3次，室温放置10min。

6)4℃，12000g离心10min，小心吸弃上清，可见乳白色沉淀。

7)加入0.19ml75％乙醇，涡旋混匀。

8)4℃，10000g离心8min，小心吸弃上清。

9)于超净工作台开盖放置10min，使残余酒精挥发。加入rnase-freeddh2o(上海索宝生物科技有限公司)20μl，反复吹打20次混匀，充分溶解rna。

10)微量分光光度计测定rna的浓度，备用。

反转录cdna：

1)冰上融化试剂盒各组分

2)配置反应体系(以下用量均为一个样品，多个样品自行换算)

表4反应体系1

*随机引物为5’-nnnnnn-3’，n为随机碱基，寡核苷酸引物为5’-ttttttttttttttt-3’，均为试剂盒自带。

表5反应体系2

3)离心，将配置好的反应体系1离心于管底，在常规pcr仪上70℃孵育5min，完成后立即置于冰上3min。

4)将配置好的反应体系2加入到反应体系1中，25℃孵育5min，42℃孵育50min，70℃孵育15min，4℃备用。

qpcr

1)冰上融化各组分

2)配置反应体系(以下用量均为一个样品，多个样品自行换算)

表6反应体系3

*pcr核苷酸混合物(pcrnucleotidemix)为预先混合的datp,dctp,dgtp和dttp的钠盐，各自的浓度为10mm，总浓度为40mm(ph7.5)。试剂盒预混成品。

ben3-fp：5’-caaatgtccaaagaagtaaatgctaga-3’(seqidno:23)

ben3-rp：5’-ggcatccatcagcaggaatt-3’(seqidno:24)

3)程序如下

表7

*ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值(例如在本实施例中，是最大荧光强度的1/10)时所经历的循环数。

实施例9复制可控型病毒的qpcr测定结果

将野生型流感病毒a/wsn/1933用pbs缓冲液进行梯度稀释，制备不同数量级拷贝数的标准品1-8。空白对照使用pbs缓冲液。ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数，3份平行样品取平均值。sd值代表标准差。

表8qpcr标准曲线的绘制数据

根据测量结果绘制回归曲线，参见图5。

根据标准品测得的回归方程如下：

y＝-3.1656x+39.415

r2＝0.9965；slope＝-3.1656

扩增效率e＝10^-1/slope＝2.07

实施例10qpcr有效性验证实验

参考《中国药典》2015版生物样品定量分析方法验证指导原则及药物质量标准分析方法验证指导原则，针对复制可控型流感病毒开发的qpcr法进行方法学验证，确认参数包括：特异性、重复性和精密度。

特异性：

以不同种属细胞基因组dna为模板，按照本检测方法进行测试。实验样品均为自行提取。实验结果显示，除复制缺陷型流感病毒基因组cdna有扩增曲线外，参照组大肠杆菌bl基因组dna、大肠杆菌dh5α基因组dna、载体pbudce4.1基因组dna均无扩增反应(参见图6)。

重复性：

将8份复制可控型流感病毒样品分别按三次测量取平均值，并计算标准差和变异系数。

可接受标准：变异系数≤15％。

表9

平均值avg＝28.144；

标准差sd＝1.940；

变异系数cv＝sd/avg*100％＝6.892％

精密度：

取三批样品，稀释到拷贝数约为1×10⁴，同时取实施例9中拷贝数为2.4×10⁸标准品2，按下表混合并检测实际拷贝数：

表10

按照以下公式计算病毒的回收率：

回收率＝检测标准的加入量/理论加入量×100％

可接受标准：回收率＝80～120％。

表11

回收率区间：98.68％～107.84％，符合可接受标准。该回收率指标代表了qpcr过程中cdna的损失情况，回收率越高代表cdna的损失越小，从而精密度越高。

结果显示方法的特异性，重复性和精密度等指标均可达到方法验证的基本要求，可用于复制可控型流感病毒的定量测定。