一种产油酵母菌的培养方法、微生物油脂生产方法及其应用与流程

本发明属于废水处理技术领域，尤其涉及一种产油酵母菌的培养方法、微生物油脂生产方法及其应用。

背景技术：

生物柴油是一种绿色可再生资源，燃烧性能好，含硫量低，能够替代化石燃料。生物柴油的生产技术分为三代，第一代生物柴油技术从食用性油料作物如油菜籽和大豆中生产生物柴油，该技术成熟并已实现工业化，但种植油料作物需要大量土地资源，会出现与粮食生产竞争土地的问题，同时其产量也远远未能满足快速增长的需求；第二代生物柴油技术从非食用性油料作物如麻风树中生产生物柴油，该技术尚未成熟，并有与第一代生物柴油技术相似的问题，或者从废煎炸油如地沟油或动物油脂中生产生物柴油，会因原材料来源有限而受到限制；第三代生物柴油技术采用产油微生物生产生物柴油，成为了生物柴油产业的新希望。

采用产油微生物生产生物柴油相比于采用油料作物有很多优势，油脂产量比油料作物高，耗水量更少，能在多种环境中生长，不需要和传统农业争夺土地资源，不需要除草剂和杀虫剂。但是，早期的微藻培养生产生物柴油需要使用大量化肥确保产量，化肥的使用会增加成本，并有造成二次污染的风险。所以，使用废水中的有机物和营养物或者农业废料作为培养产油微生物的肥料是更好的选择；另一方面，食品工业废水有机物含量高，非常适合产油微生物的生长。

然而，采用废水进行产油微生物的培养，杂菌污染问题突显，废水中的有机物和营养物多，适于很多种类微生物的繁殖，并且生长速度更快的原生细菌和真菌比外加的产油微生物更具有生长优势，对产油微生物的生长和产油有不利影响。例如在畜牧业废水中，无菌条件下的微藻的油脂产量是非无菌条件下的1.3-1.7倍，即杂菌的生长会使微藻的油脂产量降低20％-40％。

早期的第三代生物柴油技术，使用的是海水或淡水来培养微藻。由于海水或淡水有机物和氮磷等营养物质含量低、固体悬浮物少和粘度相对低易于过滤等特点，主要通过过滤除菌的方法，控制杂菌污染。与此同时，营养物质含量低也导致了油脂产量低，需要添加化肥确保产量。但是，废水中的固体悬浮物相对多，有机物和氮磷等营养物质物质含量高，部分废水具有轻微粘性，容易堵塞滤网，不便于使用过滤除菌，使得采用废水培养产油酵母生产微生物油脂主要停留在实验室研究阶段，控制杂菌污染主要采用高温蒸汽灭菌。但是，高温蒸汽灭菌需要消耗大量的能源。从生产的角度，对于废水的巨大水量，采用高温蒸汽灭菌对设备的要求高。使用抑菌剂或抗生素等会很可能产生二次污染，影响后续水处理工艺过程的效率。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明提供了一种产油酵母菌的培养方法、微生物油脂生产方法及其应用，用于解决采用废水制备微生物油脂杂菌污染问题突显，采用高温高压灭菌控制杂菌污染能耗大、设备要求高等的问题。

本发明的具体技术方案如下：

本发明提供了一种产油酵母菌的培养方法，包括以下步骤：

将产油酵母菌接种至pH值为3.3～4的培养液中进行培养，其中，所述产油酵母菌在所述培养液中的初始浓度为(1～2)×10⁸cells/mL。

本发明产油酵母菌的培养方法中，产油酵母菌在培养液中的初始浓度为(1～2)×10⁸cells/mL能够大大缩短产油酵母菌生长到稳定期的时间，能够在培养液原生微生物生长起来之前迅速成为优势菌，避免了培养液原生微生物带来的影响，无需控制培养条件为无菌条件就可进行产油酵母菌的培养，降低了产油酵母菌的培养成本。

本发明还提供了一种微生物油脂的制备方法，包括以下步骤：

a)将产油酵母菌接种至pH值为3.3～4的培养液中进行发酵，得到发酵产物，其中，所述产油酵母菌在所述培养液中的初始浓度为(1～2)×10⁸cells/mL；

b)将所述发酵产物进行收集，再进行油脂提取，得到微生物油脂。

本发明中，采用产油酵母菌在酸性条件的培养液中进行发酵，产油酵母菌在废水中的初始浓度为(1～2)×10⁸cells/mL，大大缩短了产油酵母菌生长到稳定期的时间，使得产油酵母菌在原生微生物生长起来之前迅速成为培养液中的优势菌，避免了培养液中的原生杂菌带来的影响，无需控制发酵条件为无菌条件就可进行发酵得到发酵产物，发酵产物具有富含油脂的菌体，再进行油脂提取，得到微生物油脂，能够在培养液中进行微生物油脂的有效生产，该制备方法简单易行，无需高温高压灭菌创造无菌条件，可大大降低灭菌造成的能耗和设备要求，易于在工业上应用。

优选的，步骤a)所述发酵的温度为20℃～35℃；

步骤a)所述发酵的时间为12h～24h。

步骤a)所述发酵的通气比为3vvm～4.5vvm；

步骤a)所述发酵的溶解氧浓度为30％～100％空气饱和度。

优选的，所述培养液为酿酒废水；

所述酿酒废水的化学需氧量(COD)为17,120mg/L～65,075mg/L，更优选为20,315mg/L～22,736mg/L。

本发明中，酿酒废水为在豉香型白酒生产过程中得到的发酵黄水废液。本发明采用酿酒废水制备微生物油脂，能够对酿酒废水进行再利用，利用酿酒废水中的有机物进行产油酵母菌的培养，实现产油酵母菌对酿酒废水进行同步净化和产油，无需高温高压创造无菌条件，具有设备要求低、操作简单、发酵反应时间短的优点，易于在工业上应用。并且，该制备方法在对酿酒废水进行资源化利用的同时，对酿酒废水进行净化，解决了酿酒废水排放量巨大且日益增长、处理困难的问题。酿酒废水有机物含量高，非常适合产油酵母菌的生长，并且排放量巨大且日益增长，是一种优质的可能源化利用的资源。

需要说明的是，培养液还可采用同类食品工业废水，此处不做具体限定。

当酿酒废水的化学需氧量较高时，可采用生活废水、自来水或蒸馏水对酿酒废水进行稀释。酿酒废水的pH值高于3.3时不需调节，pH值低于3.3时将pH值调节到4。

本发明中，产油酵母菌在酿酒废水中的初始浓度优选为2×10⁸cells/mL，实验结果表明在该初始浓度下，产油酵母菌的油脂产量大，油脂含量稳定，油脂产速快，并且，使产油酵母菌在酿酒废水中的初始浓度达到2×10⁸cells/mL所需的成本较低。

优选的，所述产油酵母菌选自圆红冬孢酵母。

本发明步骤a)优选为：将产油酵母菌接种至化学需氧量为20,315mg/L～22,736mg/L、pH值为3.3的酿酒废水中，产油酵母菌在酿酒废水中的初始浓度为2×10⁸cells/mL，再在温度为30℃、通气比为4vvm、溶解氧浓度为60％空气饱和度的条件下进行12h的发酵，得到富含油脂的酵母菌体/菌泥/生物质。

优选的，所述产油酵母菌的制备方法包括以下步骤：

将所述产油酵母菌种接种至pH值为4～5的扩大培养基中，进行扩大培养，得到所述产油酵母菌。

优选的，所述扩大培养的温度为20℃～35℃，更优选为30℃；

所述扩大培养的时间为8h～24h，更优选为8～16h，进一步优选为8～12h。

所述扩大培养的通气比为3vvm～4.5vvm，更优选为4vvm；

所述扩大培养的溶解氧浓度为40％～100％空气饱和度，更优选为60％～90％空气饱和度。

本发明中，无需控制培养条件为无菌条件进行扩大培养，利用产油酵母菌种具有良好的耐酸性，将扩大培养基的pH值调节至4～5，可以有效防止环境微生物的污染，免除高温灭菌步骤。

本发明中，产油酵母菌种在扩大培养基的初始接菌量为1％～5％(v/v)，优选为5％(v/v)，初始接菌量越大，扩大培养的时间越短。

本发明中，扩大培养所用的扩大培养基选自酵母浸出粉胨葡萄糖(YPD)培养基和/或马铃薯葡萄糖(PDA)琼脂培养基，优选为酵母浸出粉胨葡萄糖培养基，扩大培养基置于有曝气装置的开放式容器。

本发明中，所述产油酵母菌的浓度为(4～10)×10⁹cells/mL，更优选为5×10⁹cells/mL。

本发明中，通过对产油酵母菌进行离心收集，4000rpm离心10min，去上清液收集菌体，使用血球计数板对菌体进行计数，并根据计数值调节产油酵母菌的浓度至(4～10)×10⁹cells/mL。

优选的，扩大培养之前，还包括：

在灭菌的种子培养基中对所述产油酵母菌种进行种子培养。

本发明中，种子培养基中的菌体终浓度为(1.19±0.18)×10⁸cells/mL。

种子培养基选自酵母浸出粉胨葡萄糖培养基或马铃薯葡萄糖琼脂培养基，优选为酵母浸出粉胨葡萄糖培养基。种子培养基置于锥形瓶中封口并灭菌。

在灭菌的种子培养基中对所述产油酵母菌种进行种子培养具体包括：将产油酵母菌种在超净台中用接种环接种至种子培养基中，于30℃恒温摇床、摇速200rpm下进行24h种子培养。

本发明中，产油酵母菌种的制备方法如下：

将原始产油酵母菌种进行活化，得到产油酵母菌种。

将原始产油酵母菌种进行活化具体包括：把固体培养基上的产油酵母菌落，接种到新鲜的固体种子培养基，30度培养2-3天，直至能观察到明显的酵母菌落。

本发明中，扩大培养的环境为邻近垃圾站等腐败产酸菌较多的场地时，扩大培养基的pH优选为4.5～5，产油酵母菌种在扩大培养基的接菌量为5％(v/v)，扩大培养的时间为8h，减少产酸耐酸菌污染的风险；扩大培养的环境为周边环境腐败产酸菌较少的场地时，扩大培养基的pH优选为4，并且，在原始产油酵母菌种活化后无需进行种子培养，可直接吸取扩大培养基，从固体平板上把菌体洗脱到扩大培养基中，进行24h扩大培养。

本发明还提供了上述技术方案所述方法制备得到的微生物油脂。

本发明还提供了上述技术方案微生物油脂在制备生物柴油中的应用。

本发明制备得到的微生物油脂可以进一步转化为生物柴油，实现在无需高温高压灭菌条件进行酿酒废水的资源化利用，同步净水产油，大大降低了工艺能耗和对设备的要求，易于在实际应用。

综上所述，本发明提供了一种微生物油脂的制备方法，包括以下步骤：a)将产油酵母菌接种至pH值为3.3～4的培养液中进行发酵，得到发酵产物，其中，所述产油酵母菌在所述培养液中的初始浓度为(1～2)×10⁸cells/mL；b)将所述发酵产物中的富含油脂的菌体进行收集，再进行油脂提取，得到微生物油脂。本发明采用培养液制备微生物油脂的方法，无需控制发酵条件为无菌条件就可进行发酵得到发酵产物，发酵产物具有富含油脂的菌体，能够实现产油酵母菌产油，设备要求低、操作简单、发酵反应时间短，易于在工业上应用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为本发明实施例1中空白YPD培养基及圆红冬孢酵母菌种在不同pH值的扩大培养基中扩大培养24h的结果图，其中，前排3个反应器为没有接种圆红冬孢酵母菌种的空白YPD培养基，后排从左到右依次是圆红冬孢酵母菌种在pH值为4、4.5和5的扩大培养基中扩大培养24h的结果图；

图2为本发明实施例1中空白YPD培养基(pH值为4～5)及圆红冬孢酵母菌种在pH值为4～5的YPD培养基中扩大培养40h离心后的结果图，其中，左图为没有接种圆红冬孢酵母菌种的空白YPD培养基开放培养40h离心后的结果图，右图为圆红冬孢酵母菌种在pH值为4～5的YPD培养基中扩大培养40h离心后的结果图；

图3为本发明实施例1中圆红冬孢酵母菌种在pH值为4的YPD培养基中扩大培养40h离心后的结果图；

图4为本发明实施例2中圆红冬孢酵母菌在不同化学需氧量的酿酒废水中进行发酵的结果图，从左至右酿酒废水的化学需氧量依次为17,120mg/L、22,736mg/L、25,457mg/L和28,080mg/L；

图5为本发明实施例3中不同初始接菌浓度(0.5×10⁸cells/mL、1×10⁸cells/mL、1.5×10⁸cells/mL和2×10⁸cells/mL)对应不同通气比(0.9vvm、1.8vvm、2.7vvm和3.6vvm)下的溶解氧浓度随时间变化的图；

图6为本发明实施例3中圆红冬孢酵母菌在酿酒废水中的初始浓度不同时进行发酵的结果图，其中，从左至右圆红冬孢酵母菌在酿酒废水中的初始浓度分别依次为0.5×10⁸cells/mL、1×10⁸cells/mL、1.5×10⁸cells/mL和2×10⁸cells/mL；

图7为本发明实施例3中圆红冬孢酵母菌在酿酒废水中的初始浓度不同时进行发酵后的总菌体干重和杂菌干重图，其中，实线为总菌体干重，虚线为杂菌干重图；

图8为本发明实施例3中圆红冬孢酵母菌在酿酒废水中的初始浓度不同时进行发酵后的油脂产量图和油脂含量图，其中，(a)油脂产量，(b)菌体干重中油脂含量；

图9为本发明实施例4中圆红冬孢酵母菌在不同通气比下在酿酒废水中进行发酵后的菌体干重和油脂产量图，(a)实线图为菌体干重，虚线图为白色原生杂菌干重，(b)油脂产量；

图10为本发明实施例4中圆红冬孢酵母菌在不同通气比下在酿酒废水中进行发酵后的酿酒废水的各项水质参数变化图，化学需氧量(COD)(a)、总磷(b)、总氮(c)、氨氮(d)、pH(e)和溶解氧(f)。

具体实施方式

本发明提供了一种产油酵母菌的培养方法、微生物油脂生产方法及其应用，用于解决采用废水制备微生物油脂杂菌污染问题突显，采用高温高压灭菌控制杂菌污染能耗大、设备要求高等的问题。

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本实施例进行圆红冬孢酵母菌的制备，包括以下步骤：

(1)制备种子培养基：种子培养基为酵母浸出粉胨葡萄糖培养基(Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，YPD培养基)，按照YPD培养基配方(酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L)配制40mL YPD培养基，置于锥形瓶中封口并灭菌。

(2)制备圆红冬孢酵母菌种：将原始圆红冬孢酵母菌种在固体培养基中进行活化后，在超净台中用接种环接种至种子培养基中，于30℃恒温摇床、摇速200rpm下进行24h种子培养，得到圆红冬孢酵母菌种。

(3)制备扩大培养基：扩大培养基为YPD培养基，按照YPD培养基配方配制500mL YPD培养基，将扩大培养基的pH值调节至4，无需灭菌直接置于有曝气装置的开放式容器中。

(4)进行圆红冬孢酵母菌种的扩大培养：在开放条件下，将步骤(2)圆红冬孢酵母菌种接种至pH值为4～5的扩大培养基中，再在温度为20℃～30℃、通气比为4vvm、初始溶解氧浓度为80％～90％空气饱和度下进行扩大培养，得到圆红冬孢酵母菌。其中，圆红冬孢酵母菌种在扩大培养基的接种量为(1％和5％，v/v)。

请参阅图1，图1为本发明实施例1中空白YPD培养基及圆红冬孢酵母菌种在不同pH值的扩大培养基中扩大培养24h的结果图，其中，前排3个反应器为没有接种圆红冬孢酵母菌种的空白YPD培养基，从左到右pH值依次为4、4.5和5；后排从左到右依次是圆红冬孢酵母菌种在pH值为4、4.5和5的扩大培养基中扩大培养24h的结果图。

请参阅图2，图2为本发明实施例1中空白YPD培养基及圆红冬孢酵母菌种在pH值为4～5的扩大培养基中扩大培养40h离心后的结果图，其中，左图为没有接种圆红冬孢酵母菌种的空白YPD培养基离心后的结果图，右图为圆红冬孢酵母菌种在pH值为4～5的扩大培养基中扩大培养40h离心后的结果图。

本实施例中，图2左图通过收集图1前排空白YPD培养基离心得到，图2右图通过收集图2后排圆红冬孢酵母菌离心得到，离心的转速为10000rpm，离心的时间为10min。图1和图2表明，圆红冬孢酵母菌种在pH值为4、4.5和5的YPD培养基中扩大培养24h呈现稳定期的红色，而pH值为4、4.5和5的空白YPD培养基以及圆红冬孢酵母菌种在pH值为4～5的YPD培养基中扩大培养40h离心后没有杂菌泥(白色)出现，表明扩大培养基pH值为4～5时，不容易被污染；同时扩大培养只需将圆红冬孢酵母菌培养到生长期，培养时间短于24h，杂菌污染风险比培养到稳定期更低。本实施例制备得到的圆红冬孢酵母菌作为后续实施例的种子液，在传统酵母菌摇瓶培养中，酵母菌48h达到稳定期，24h的培养液可用作种子液，所以该条件下培养12h制备得到的圆红冬孢酵母菌满足种子液的需求。

请参阅图3，图3为本发明实施例1中圆红冬孢酵母菌种在pH值为4的YPD培养基中扩大培养40h离心后的结果图。离心的转速为10000rpm，离心的时间为10min，离心去上清富集菌体的次数为两次。图3表明，扩大培养基的pH值为4时，无需控制培养条件为无菌条件进行扩大培养，圆红冬孢酵母菌种扩大培养后的菌泥没有其它杂菌污染(若有污染，经两次离心富集的两层菌泥中间和顶部会出现白色杂菌带)，圆红冬孢酵母菌为优势菌，菌泥全部呈红色。

实施例2

本实施例对圆红冬孢酵母菌进行离心收集，4000rpm离心10min，去上清液收集菌体，浓缩至4支50mL离心管中，使用血球计数板对离心管中的菌体进行计数，根据计数值调节离心管中的菌体浓度至5×10⁹cells/mL，再将菌体浓度为5×10⁹cells/mL的圆红冬孢酵母菌接种至500mL不同化学需氧量的酿酒废水中，圆红冬孢酵母菌在酿酒废水中的初始浓度为1×10⁸cells/mL，然后在pH值为3.3、温度为23℃～30℃、通气比为1.8vvm、初始溶解氧浓度为35～55％空气饱和度下进行48h的发酵，得到发酵产物。

不同化学需氧量的酿酒废水通过采用蒸馏水进行稀释得到，本实施例酿酒废水设置了四组，每组的稀释倍数依次为4、3、2.5和2，对应化学需氧量依次为17,120mg/L、22,736mg/L、25,457mg/L和28,080mg/L，每组设2个平行试验。

请参阅图4，为本发明实施例2中圆红冬孢酵母菌在不同化学需氧量的酿酒废水中进行发酵的结果图，从左至右酿酒废水的化学需氧量依次为17,120mg/L、22,736mg/L、25,457mg/L和28,080mg/L。图4表明，酿酒废水的稀释倍数为3～4，对应化学需氧量为22,736mg/L～17,120mg/L时，圆红冬孢酵母菌呈现正常生长的红色，而酿酒废水的稀释倍数为2～2.5，对应化学需氧量为25,457mg/L～28,080mg/L时，圆红冬孢酵母菌呈现受抑制的黑色，可知，酿酒废水的稀释倍数优选为3，化学需氧量优选为22,736mg/L。

实施例3

本实施例对圆红冬孢酵母菌进行离心收集，4000rpm离心10min，去上清液收集菌体，浓缩至4支50mL离心管中，使用血球计数板对离心管中的菌体进行计数，根据计数值调节离心管中的菌体浓度至5×10⁹cells/mL，再将菌体浓度为5×10⁹cells/mL的圆红冬孢酵母菌接种至500mL化学需氧量为20,163mg/L的酿酒废水中，酿酒废水设置了四组，每组设2个平行试验，圆红冬孢酵母菌在酿酒废水中的初始浓度分别依次为0.5×10⁸cells/mL、1×10⁸cells/mL、1.5×10⁸cells/mL和2×10⁸cells/mL，然后在pH值为3.3、温度为23℃～30℃、初始溶解氧浓度为35％-55％空气饱和度下进行发酵，每组通气比分别依次为0.9vvm、1.8vvm、2.7vvm和3.6vvm，每24h取一次样，样品于4000rpm离心10min，得到菌体，菌体再用去离子水清洗1次，105℃烘干至恒重，测量菌体干重和油脂产量，油脂产量测定方法采用酸热法。

请参阅图5，为本发明实施例3中不同初始接菌浓度(0.5×10⁸cells/mL、1×10⁸cells/mL、1.5×10⁸cells/mL和2×10⁸cells/mL)对应不同通气比(0.9vvm、1.8vvm、2.7vvm和3.6vvm)下的溶解氧浓度随时间变化的图。图5表明，圆红冬孢酵母菌在酿酒废水中的初始浓度不同时，需对应设置不同的通气比，才能获得相同的初始溶解氧浓度。

请参阅图6，为本发明实施例3中圆红冬孢酵母菌在酿酒废水中的初始浓度不同时进行发酵的结果图，其中，从左至右圆红冬孢酵母菌在酿酒废水中的初始浓度分别依次为0.5×10⁸cells/mL、1×10⁸cells/mL、1.5×10⁸cells/mL和2×10⁸cells/mL。图6表明，圆红冬孢酵母菌在酿酒废水中的初始浓度为1×10⁸cells/mL时，圆红冬孢酵母菌有可能不能成为酿酒废水中的优势菌，而被白色原生杂菌取代，当圆红冬孢酵母菌在酿酒废水中的初始浓度大于等于1.5×10⁸cells/mL时，圆红冬孢酵母菌在酿酒废水中成为优势菌，菌液呈红色。

请参阅图7，为本发明实施例3中圆红冬孢酵母菌在酿酒废水中的初始浓度不同时进行发酵后的总菌体干重和杂菌干重图，其中，实线为总菌体干重，虚线为杂菌干重图。图7表明，相对于圆红冬孢酵母菌在酿酒废水中的初始浓度为0.5×10⁸cells/mL，初始浓度为(1～2)×10⁸cells/mL能够大大缩短产油酵母菌生长到稳定期的时间，能够在酿酒废水原生微生物生长起来之前迅速成为优势菌，避免酿酒废水原生微生物带来的影响。并且，当初始浓度为2×10⁸cells/mL时，菌体总重在两天内达到最大值，而且数值显著大于其它实验组(p<0.05)。

请参阅图8，为本发明实施例3中圆红冬孢酵母菌在酿酒废水中的初始浓度不同时进行发酵后的油脂产量图和菌体干重中油脂含量图，其中，(a)油脂产量，(b)菌体干重中油脂含量。图8a表明，圆红冬孢酵母菌在酿酒废水中的初始浓度为2×10⁸cells/mL时，圆红冬孢酵母菌的油脂产量在1天内达到最大值，而且油脂产量显著大于其它实验组(p<0.05)，图8b表明，油脂含量在培养1天时达到最大值。在培养1天时，圆红冬孢酵母菌在酿酒废水中的初始浓度为2×10⁸cells/mL，油脂含量显著高于初始浓度为1×10⁸cells/mL和1.5×10⁸cells/mL(p<0.05)。在油脂含量方面，初始浓度为2×10⁸cells/mL和初始浓度为0.5×10⁸cells/mL相比没有显著差异(p>0.05)，但是初始浓度为0.5×10⁸cells/mL的标准误差明显大于初始接菌浓度为2×10⁸cells/mL的实验组，而且油脂产量也显著小于该实验组(p<0.05)。图8表明，初始浓度为2×10⁸cells/mL时，油脂产量最高，菌体干重中油脂含量相对高，而且更稳定，油脂产量到达最高的时间可缩短至24h。

实施例4

本实施例对圆红冬孢酵母菌进行离心收集，4000rpm离心10min，去上清液收集菌体，浓缩至4支50mL离心管中，使用血球计数板对离心管中的菌体进行计数，根据计数值调节离心管中的菌体浓度至5×10⁹cells/mL，再将菌体浓度为5×10⁹cells/mL的圆红冬孢酵母菌接种至500mL化学需氧量为20,315mg/L的酿酒废水中，圆红冬孢酵母菌在酿酒废水中的初始浓度为2×10⁸cells/mL，酿酒废水设置了四组，每组设2个平行试验，每组通气比分别依次为3vvm、3.5vvm、4vvm和4.5vvm，然后在pH值为3.4、温度为23℃～30℃、溶解氧浓度为30％～100％空气饱和度下进行发酵，每12h取一次样，样品于4000rpm离心10min收集，得到菌泥(菌体)，菌泥的顶层为白色杂菌，将菌泥顶层白色杂菌通过轻微震荡重悬，再将含有杂菌的上清液10000rpm离心10min收集杂菌菌体，滤液4℃保藏，用于COD等各项水质参数的测定，水质参数按照国标法测定。菌体再用去离子水清洗1次，105℃烘干至恒重，测量菌体干重和油脂产量，油脂产量测定方法采用酸热法。

请参阅图9，为本发明实施例4中圆红冬孢酵母菌在不同通气比下在酿酒废水中进行发酵后的菌体干重和油脂产量图，(a)实线图为菌体干重，虚线图为白色原生杂菌干重，(b)油脂产量。请参阅图10，为本发明实施例4中圆红冬孢酵母菌在不同通气比下在酿酒废水中进行发酵后的酿酒废水的各项水质参数变化图，化学需氧量COD(a)、总磷(b)、总氮(c)、氨氮(d)、pH(e)和溶解氧(f)。

图9表明，油脂产量在12h达到最大值。当通气比为4和3.5vvm时，油脂产量和菌体总重差异不显著(p>0.05)。但是12h时，通气比为4vvm时的油脂产量的平均值比通气比为3.5vvm的样品大，而且标准误差更小；通气比为4vvm时，油脂产量较大且更稳定，优选通气比为4vvm。通气比为4vvm时，圆红冬孢酵母菌可以在12h内生长到稳定期，油脂产量最大，且该条件下圆红冬孢酵母菌占比大，白色原生杂菌在48h才出现，且占比很小，油脂产量可达1.92±0.24g/L，油脂产率可达160mg/(L·h)。

图10表明，通气比为4和3.5vvm时，能够在前12h内完成大部分化学需氧量、总氮、总磷和氨氮的去除，12h后各项水质参数变化不明显而氨氮浓度会变大，反应时间可以缩短至12h。在化学需氧量、总氮、总磷和氨氮去除方面，通气比为4和3.5vvm的实验组没有显著差异(p>0.05)，但在12h时，通气比为4和3.5vvm的实验组都显著大于通气比为3和4.5vvm的实验组。因为在培养12h时，通气比为4vvm时油脂产量平均值更大且标准误差更小，更稳定，优选通气比为4vvm。(通气比为3，3.5，4和4.5vvm对应的初始溶解氧浓度依次分别为2％～60％，40％～60％,50％～70％和83％～103％空气饱和度)。图10表明酿酒废水的COD、总磷、总氮和氨氮去除率分别依次可达71.82±0.52％，79.53±1.77％，54.39±6.45％和83.42±3.07％。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。