一种筛选双孢蘑菇耐高温菌株的方法与流程

本发明涉及一种筛选双孢蘑菇耐高温菌株的方法，属于食用菌育种技术领域。

背景技术：

双孢蘑菇（Agaricusbisporus），中文别名为蘑菇、洋蘑菇、白蘑菇。其含有丰富的蛋白质、多糖、维生素、核苷酸和不饱和脂肪酸，不仅营养丰富，肉质肥美，味道鲜美，而且热能低，具有很高的医疗保健作用，日益受到各国人民的喜爱。据中国食用菌学会统计，2015年全国双孢蘑菇总产量达337多万吨，其中双孢蘑菇工厂化日产达到417吨，说明双孢蘑菇在国内越来越受消费者们的青睐。

双孢蘑菇属于低温型食用菌，温度是双孢蘑菇生长发育的一个重要因子。夏秋高温季节，双孢蘑菇菌丝、子实体的生长受到严重伤害，致使生产量下降，造成供应淡季，直接影响到产业者的收入和消费者的饮食生活。另外，高温不仅影响双孢蘑菇的产量，主要表现在在高温环境中菌丝生长缓慢，纤弱，菌种易发生烧菌，播种后菌种萌发期长，易引发各种污染和病害等。然而，缺乏筛选双孢蘑菇耐高温菌株的方法。因此，建立选育双孢蘑菇耐高温菌株的方法，筛选耐高温菌株是解决当前问题的关键。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种筛选双孢蘑菇耐高温菌株的方法。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种筛选双孢蘑菇耐高温菌株的方法，包括下列步骤：

步骤1：将双孢蘑菇的栽培菌株接种到PDA平板培养基上，培养5-7天后，分别用不同温度进行处理，确定双孢蘑菇菌株的致死温度为N℃；

步骤2：将待筛选的双孢蘑菇菌株接种到PDA平板培养基上生长5-7天，接种的双孢蘑菇菌株长出新鲜的菌丝；

步骤3：将步骤2得到的萌发的菌株连同PDA平板培养基一起在N+1℃条件下进行培养22-26h；

步骤4：将菌落颜色为白色或浅白色的菌落转接到新的PDA平板培养基上生长5-7天，然后在N+1℃条件下进行培养22-26h，接着在25℃条件下继续培养，如果在25℃条件下继续生长，则为双孢蘑菇耐高温菌种。

优选的技术方案为：步骤1中，用用同温度进行处理24h，当菌丝的颜色由白色变为褐色，则该温度即为双孢蘑菇菌株的致死温度为N℃。

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有的优点是：

本发明的方法用于鉴定双孢蘑菇耐高温菌株，具有耗时短，操作简便，精准度高，成本低的优点。

附图说明

图1高温处理双孢蘑菇菌落颜色变化情况（W192）。

图2高温处理双孢蘑菇菌落颜色变化情况（W15）。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。

本说明书中所引用的如“上”、“下”、“左”、“右”、“中间”及“一”等的用语，亦仅为便于叙述的明了，而非用以限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容下，当亦视为本发明可实施的范畴。

实施例1：一种筛选双孢蘑菇耐高温菌株的方法

分别将双孢蘑菇A15和W192栽培菌株转接到PDA平板培养基上，待生长6天后，分别用不同温度处理，发现A15菌株的致死温度为39℃（N℃=39℃），而w192的致死温度为40℃（N℃=40℃）。

将40℃（N+1℃=39+1℃）作为菌株A15的耐高温菌株筛选的温度，将41℃（N+1℃=40+1℃）作为菌株w912的耐高温菌株筛选的温度。

分别采集双孢蘑菇A15和w192菌株的成熟子实体，并分别收集子实体弹射的孢子。

将收集的孢子制成孢子悬液，孢子浓度约为10⁷，每个平板涂布100ul孢子悬液，25℃，暗处培养。

待孢子悬液萌发，菌落为肉眼可见时，将萌发的A15和W192菌株平板分别放在40℃和41℃烘箱中，培养24h。

将菌落颜色为白色或者浅白色的菌落初筛为耐高温菌株，转接到PDA平板上，菌落颜色变为褐色的菌落为非耐高温菌株，将这样的菌株淘汰，如图1。

待初筛为耐高温菌株在PDA平板上生长5-7天后，再一次用40℃处理24h，处理后转移到25℃继续培养。可以在25℃继续生长的菌株为耐高温菌株，反之淘汰。

实施例2：一种筛选双孢蘑菇耐高温菌株的方法

一种筛选双孢蘑菇耐高温菌株的方法，其特征在于：包括下列步骤：

步骤1：将双孢蘑菇的栽培菌株接种到PDA 平板上，培养5天后，分别用不同温度进行处理，确定双孢蘑菇菌株的致死温度为N℃；该N℃为41℃

致死温度是导致生物体热死的（包括在此温度下持续受热）最低温度。致死温度是可以导致死亡的最低温度。标准为：当双孢蘑菇在致死温度培养24h，菌丝的颜色由白色变为褐色，我们就把高温处理后菌丝的颜色变化作为筛选耐高温菌株的标记。

步骤2：将待筛选的双孢蘑菇菌株接种到PDA平板上生长5天，长出新鲜的菌丝；

步骤3：将步骤2得到的萌发的菌株连同PDA平板一起在N+1℃（42℃）条件下进行培养22h；

步骤4：将菌落颜色为白色或浅白色的菌落转接到新的PDA平板上生长5天，然后在42℃条件下进行培养22h，然后在25℃条件下继续培养，如果在25℃条件下继续生长，则为双孢蘑菇耐高温菌种。再次在42℃条件下进行培养22h，然后在25℃条件下继续培养，如果在25℃条件下继续生长，则为双孢蘑菇耐高温菌种，这样可以考察耐热性状的稳定性，排除假阳性。

实施例3：一种筛选双孢蘑菇耐高温菌株的方法

我们建立了一个简单快速地筛选双孢蘑菇菌丝耐高温菌株的方法和筛选耐高温菌株的显著表型。我们以高温处理后的菌丝颜色是否从白色变成褐色作为筛选标记，判定菌株的耐高温性。首先，根据双孢蘑菇孢子菌株的变异性特点，根据不同温度获得双孢蘑菇的菌丝致死温度为40℃。然后，将41℃作为筛选双孢蘑菇的筛选温度，将孢子萌发的菌株放在41℃培养24h，将菌落颜色是白色或者浅白色的菌株转移到新的培养基上，将菌落颜色为棕褐色的视为淘汰菌株。最后，将初步筛选的耐高温菌株在PDA培养基生长5天，再转移到41℃，培养24h，可以继续生长的菌株为耐高温菌株。

本发明鉴定双孢蘑菇耐高温菌株的方法，包括下列步骤：

将双孢蘑菇的正常栽培菌株转接到PDA 平板上，待生长7天后，分别用不同温度进行处理，最终获得双孢蘑菇菌株的致死温度为40℃。

当双孢蘑菇在致死温度培养24h，菌丝的颜色由白色变为褐色，我们就把高温处理后菌丝的颜色变化作为筛选耐高温菌株的标记。

然后，将耐高温筛选的温度定为比致死温度高一度，即为41℃。

将待筛选的双孢蘑菇菌株接到PDA平板上生长7天，待接种的菌块长出新鲜菌丝。

将萌发的菌株连同平板一起放在41℃烘箱中，培养24h。

将菌落颜色为白色或者浅白色的菌落初筛为耐高温菌株，转接到PDA平板上，菌落颜色变为褐色的菌落为非耐高温菌株，将这样的菌株淘汰。

待初筛为耐高温菌株在PDA平板上生长7天后，再一次用41℃处理24h，处理后转移到25℃继续培养。可以在25℃继续生长的菌株为耐高温菌株，反之淘汰。

以上所述者仅为用以解释本发明之较佳实施例，并非企图具以对本发明做任何形式上之限制，是以，凡有在相同之发明精神下所作有关本发明之任何修饰或变更，皆仍应包括在本发明意图保护之范畴。