一种复制缺陷西尼罗病毒的制备方法及应用与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种复制缺陷西尼罗病毒的制备方法及应用。

背景技术：

西尼罗病毒(westnilevirus，wnv)属于黄病毒科黄病毒属，同属其他病毒包括登革热病毒(denv)，黄热病病毒(yfv)，寨卡病毒(zikv)等。wnv在自然界中的传播循环为鸟-蚊-鸟，鸟是该病毒的贮存宿主，蚊虫为主要传播媒介，人和马可作为该病毒的偶然宿主。人感染wnv后可导致西尼罗热，并可继发为致死性脑炎、脑脊膜炎等中枢神经系统疾病。wnv最早于1937年的乌干达西尼罗地区被发现，起初仅在小范围传播，并没有引起严重的疾病，直至1999年在美国纽约暴发流行后，迅速传播至美洲大陆，引发了严重的公共卫生问题。wnv除了给人类健康带来威胁外，在北美等地也导致了大量的马匹、鸟类等家禽及野生鸟禽的感染及死亡，给养殖业和生态造成了严重影响。

wnv病毒属于生物安全三级病毒，需要在生物安全三级实验室进行活病毒的操作，极大地限制了对该病毒的研究。疫苗是预防wnv感染的有效手段，目前还没有批准上市的人用wnv疫苗。wnv疫苗的研究主要集中在灭活疫苗、减毒活疫苗、重组亚单位疫苗、dna疫苗。减毒活疫苗因免疫原性强，可引起体液和细胞免疫应答，诱导较全面而持久的免疫保护，在wnv疫苗研发中受到重视。然而该类疫苗存在毒力回复的隐患，而安全性是人用疫苗关注重点，特别是对于生物安全等级较高的三级病原应当更加重视。

wnv基因组为单股正链rna，长度约11kb。整个基因组包括5’非编码区(non-codingregion，ncr)、3’非编码区以及一个开放阅读框架(openreadingframe,orf)。开放阅读框编码一个多聚前体蛋白，在病毒和宿主蛋白酶作用下可被切割成3种结构蛋白：衣壳蛋白(capsidprotein；c)、膜蛋白(membraneprotein；m)和包膜蛋白(envelopeprotein；e)以及7种非结构蛋白：ns1、ns2a、ns2b、ns3、ns4a、ns4b和ns5。结构蛋白在病毒颗粒组装成熟中发挥着重要作用，非结构蛋白主要参与病毒基因组的复制和免疫逃逸。非结构蛋白ns1是一种高度保守的多功能糖蛋白，大小约40kd，参与病毒早期复制，并与ns4a、ns4b等蛋白存在相互作用。wnvns1蛋白对病毒免疫应答和复制非常重要，前期的研究表明wnvns1可与rig-i和mda5相互作用，从而抑制β-干扰素的产生；ns1基因突变后可影响病毒的复制，而这种复制降低可通过提供野生型的ns1来反式互补回复；yfv的ns1基因大片段缺失后病毒不能复制，通过反式提供ns1蛋白可有效互补ns1的复制缺陷，获得复制缺陷病毒。复制缺陷病毒因与野生型病毒生长相似、免疫原性相同，只能在筛选出的表达缺失基因的细胞系中复制和扩增，具有作为一种安全疫苗的潜力，近年来被广泛应用于高等级生物安全病原的疫苗研发中。

目前在黄病毒的研究中大多是通过顺次转染表达缺失基因如ns1/ns5的质粒以及缺失ns1/ns5基因的rna于细胞，互补产生缺陷病毒。因受到转染试剂，转染条件等的影响，病毒滴度通常较低，且每次扩增病毒都需要重新进行转染，费时费力。而筛选稳定表达缺失基因的细胞系，只需将缺失此种基因的rna转染至细胞系中即可互补拯救产生缺陷病毒，再次扩增病毒只需将拯救的缺陷病毒感染细胞系就可源源不断的获得大量缺陷病毒，然而筛选一株稳定高效的细胞系用时长且难度较大。申请人在前期的研究中成功筛选获得反式提供wnvns1蛋白的293tns1细胞系(zhanghl,yehq,dengcl,liusq,shipy,qincf,yuanzm,zhangb.generationandcharacterizationofwestnilepseudo-infectiousreportervirusforantiviralscreening.antiviralres.2017may；141:38-47.)，尽管该细胞系可互补wnvns1的复制缺陷，获得复制缺陷病毒,但wnv-δns1复制缺陷病毒在此细胞系上的最高滴度只能达到约10⁵ffu/ml，病毒产量低，且细胞来源不是适用生产的vero细胞，制约了其在疫苗上的研究。为此，筛选一株能稳定表达wnvns1蛋白的vero细胞来源的verons1细胞系，并能高效反式互补wnvns1的复制缺陷，获得高滴度的wnv-δns1复制缺陷病毒，将为复制缺陷病毒作为候选疫苗研发提供有效的工具。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种复制缺陷西尼罗病毒的制备方法，利用该方法制备的西尼罗病毒滴度高，其与野生型病毒wt具有相同的免疫原性，在ifnar-/-小鼠中不致病，具有很高的安全性。

本发明的另一个目的在于提供了一种复制缺陷西尼罗病毒的制备方法制备出的西尼罗病毒的应用。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

一种复制缺陷西尼罗病毒的制备方法，是将ns1缺失的西尼罗病毒在非洲绿猴肾细胞vero/wnv-ns1上进行传代培养获得，所述的非洲绿猴肾细胞vero/wnv-ns1的保藏编号为：cctccno：c2019113。

一种复制缺陷西尼罗病毒的制备方法制备出的西尼罗病毒的应用，包括利用所制备出的病毒用于西尼罗病毒疫苗的制备；或是制备成研究西尼罗病毒的试剂。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

1.本发明所拯救的wnv-δns1复制缺陷病毒只能在筛选出的表达wnvns1的细胞系中复制和扩增，可以在生物安全二级实验室进行该病毒的疫苗相关研究。

2.本发明提供的wnv-δns1复制缺陷病毒可在vero细胞来源的ns1表达细胞系中大量培养扩增，且用无血清的vp-sfm培养基培养即可获得高滴度病毒，为后续疫苗的生产提供了便利，并节约了成本。

3.本发明提供的wnv-δns1复制缺陷病毒在传代过程中稳定，未发生重组，具有很好的遗传稳定性。同时其与野生型病毒wt具有相同的免疫原性，在ifnar-/-小鼠中不致病，具有很高的安全性。

4.本发明提供的wnv-δns1复制缺陷病毒在c57bl/6小鼠模型中确定是安全的，加强免疫后可使免疫小鼠产生高水平的特异性igg抗体和中和抗体，以及产生针对wnve蛋白表位特性的cd8⁺ifn-γ⁺t细胞反应，并对小鼠提供良好的免疫保护。

5.本发明提供的wnv-δns1复制缺陷病毒在c57bl/6小鼠模型中，单次低剂量免疫后即可使免疫小鼠产生高水平的特异性igg抗体以及中和抗体，并对致死剂量的wt病毒感染的小鼠提供良好的免疫保护。

附图说明

图1为缺失非结构蛋白ns1基因的wnv克隆pacyc-wnv-δns1以及用于筛选ns1表达细胞系的真核表达质粒pbabe-wnv-ns1构建示意图。

图2为利用ns1细胞系反式互补拯救产生wnv-δns1复制缺陷病毒；

a：wnv-δns1复制缺陷病毒拯救示意图；

b：wnv-δns1复制缺陷病毒于verons1和293tns1两种细胞系上的生长曲线比较；

c：wnv-δns1复制缺陷病毒于有血清的dmem培养基和无血清的vp-sfm培养基上的生长曲线比较。

图3为本发明拯救的wnv-δns1复制缺陷病毒与wnv野生型病毒wt在生长曲线、免疫噬斑形态、结构蛋白大小上的比较；

a：wnv-δns1复制缺陷病毒与wnv野生型病毒wt生长曲线比较；

b：wnv-δns1复制缺陷病毒与wnv野生型病毒wt免疫噬斑形态比较；

c：sds-page检测wnv-δns1复制缺陷病毒与wnv野生型病毒wt结构蛋白e和capsid；

d：westernblotting检测wnv-δns1复制缺陷病毒与wnv野生型病毒wt结构蛋白e和capsid。

图4为本发明拯救的wnv-δns1复制缺陷病毒与wnv野生型病毒wt具有相同的免疫原性；

a：wnve蛋白特异性单克隆中和抗体fd011-1对wnv-δns1以及wt病毒的中和效果检测；

b：wnve蛋白特异性单克隆中和抗体fd011-2对wnv-δns1以及wt病毒的中和效果检测。

图5为wnv-δns1复制缺陷病毒稳定性与安全性检测；

a：间接免疫荧光检测传代后的wnv-δns1病毒；

b：高感染复数的wnv-δns1-gluc报告病毒分别感染verons1细胞以及vero细胞后gluc信号值检测；

c：接种了wnv-δns1以及wt的ifnar-/-小鼠生存情况。

图6为wnv-δns1复制缺陷病毒在c57bl/6小鼠模型中加强免疫后体液免疫效果评价；

a：wnv-δns1病毒在c57bl/6小鼠模型中加强免疫、攻毒流程图；

b：elisa检测初次免疫以及加强免疫wnv-δns1后的小鼠产生igg抗体滴度；

c：抗体中和实验检测初次免疫以及加强免疫wnv-δns1后的小鼠产生中和抗体滴度；

d：加强免疫wnv-δns1的小鼠在攻毒后的体重变化情况；

e：加强免疫wnv-δns1的小鼠在攻毒后的生存情况；

f：加强免疫wnv-δns1的小鼠在攻毒后的毒血情况；

g：elisa检测加强免疫wnv-δns1的小鼠在攻毒后igg抗体滴度。

图7为wnv-δns1复制缺陷病毒在c57bl/6小鼠模型中单次免疫不同剂量后体液免疫效果评价；

a：wnv-δns1病毒在c57bl/6小鼠模型中单次不同剂量免疫、攻毒流程图；

b：elisa检测免疫不同剂量wnv-δns1后的小鼠产生igg抗体滴度；

c：抗体中和实验检测免疫不同剂量wnv-δns1后的小鼠产生中和抗体滴度；

d：免疫不同剂量wnv-δns1的小鼠在攻毒后的体重变化情况；

e：免疫不同剂量wnv-δns1的小鼠在攻毒后的生存情况；

f：免疫不同剂量wnv-δns1的小鼠在攻毒后的毒血情况；

g：elisa检测免疫不同剂量wnv-δns1的小鼠在攻毒后igg抗体滴度。

图8为wnv-δns1病毒在c57bl/6小鼠模型中加强免疫后细胞免疫效果评价；

a：加强免疫wnv-δns1后的小鼠7d和14dcd8⁺ifn-γ⁺t细胞百分数；

b：加强免疫wnv-δns1后的小鼠14dcd8⁺ifn-γ⁺t细胞流式图。

具体实施方式

本部分中所涉及的质粒线性化，rna体外转录，转染，real-timepcr等实验方法，如无特殊说明，均采用本领域的常规方法。以下列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以下实施例，还可以有许多变形。因此本领域的技术人员在本发明公开内容的基础上做的修改或改进，均应属于本发明要求保护的范围。

实施例1：

利用逆转录病毒系统、通过嘌呤霉素抗性基因筛选wnvns1表达细胞系verons1

1.用于筛选ns1表达细胞系的真核表达质粒pbabe-wnv-ns1其构建方法如下：以本实验室已有的pacyc-wnv-wt野生型病毒克隆为模板，以pbabe-wnv-ns1-bamhi-f:5’-cgcggatccaccatggataggtccatagctctcacg-3’，pbabe-wnv-ns1-ecori-ha-r:5’-ccggaattcttaagcgtaatctggaacatcgtatgggtaagcattcacttgtgactgc-3’为引物，用primestarhs酶pcr扩增，回收pcr产物，pcr反应体系为：94℃2min，94℃20s，55℃10s，68℃2min，68℃10min，30个循环。回收后的片段用bamhi和ecori进行双酶切，与用相同酶处理的pbabe-puro连接后转化至大肠杆菌感受态dh5α；质粒均经过dna测序鉴定为正确，命名为wnvns1真核表达质粒pbabe-wnv-ns1。克隆构建示意图如图1。

2.缺失非结构蛋白ns1基因的克隆pacyc-wnv-δns1，其序列为seqidno.1所示。构建方法如下：以本实验室已有的pacyc-wnv-wt野生型病毒克隆为骨架，将ns1基因的4-298位氨基酸进行缺失，得到pacyc-wnv-δns1。具体地，以pacyc-wnv-wt为模版，分别以f1和r1，f2和r2为引物(引物序列为f1:5’-caacctggcagaggtccgcagttattgctattt-3’，r1:5’-gtggtggtgcgcccagtgtcagcgtgcacgt-3’，f2:5’-ctgacactgggcgcaccaccacagagagcgg-3’，r2:5’-acatgcatgctgatcttggctgtccacctc-3’)，用primestarhs酶pcr扩增，回收pcr产物，以所得的2段pcr回收产物为模板，融合pcr扩增，引物为f1和r2，回收pcr产物。pcr反应体系均为：94℃2min，94℃20s，55℃10s，68℃3min，68℃10min，30个循环。回收后的融合片段用econi和sphi进行双酶切，与用相同酶处理的pacyc-wnv-wt连接后转化至大肠杆菌感受态hb101；质粒经过dna测序鉴定为正确，命名为缺失非结构蛋白ns1基因的克隆pacyc-wnv-δns1。克隆构建示意图如图1。

3.缺失非结构蛋白ns1基因的wnv克隆pacyc-wnv-δns1体外转录rna：用xbai对pacyc-wnv-δns1质粒进行线性化，经0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定线性化完全后，进行酚氯仿抽提，最后加入11μl无rnaase的水溶解，使用thermoscientificnanodrop2000测定dna的浓度并电泳检测dna的质量。取1μg酚氯仿抽提后的dna作为模板，使用体外转录试剂盒t7mmessagemmachinekit(ambion)，按照试剂盒说明书转录得到重组wnv-δns1的rna。用thermoscientificnanodrop2000测定rna的浓度，使用0.8％新鲜制备的琼脂糖凝胶电泳检测rna的质量，于-80℃保存备用。

4.ns1表达细胞系verons1筛选用到的方法同293tns1(zhanghl,yehq,dengcl,liusq,shipy,qincf,yuanzm,zhangb.generationandcharacterizationofwestnilepseudo-infectiousreportervirusforantiviralscreening.antiviralres.2017may；141:38-47.)，细胞系的筛选过程如下：1)表达wnvns1的逆转录病毒包装：在10cm细胞培养皿中接种2×10⁶个293t细胞，使细胞转染时密度达到80％左右；准备2个1.5ml离心管，分别标记为a和b，其中a中加入400μl的2×hbs，b中加入4μgpbabe-wnv-ns1+3.25μgplp/vsvg+5μgm57+40μl2.5mol/lcacl2，用无菌水补齐至400μl，用枪吹打混匀，将b中混合液缓慢加入a中，边加边混，加完之后快速吹打混合液，立即加至细胞中，6-8h后更换6ml新的含10％fbs的dmem培养基；于转染后48h，收取培养皿中的上清，用0.45μm的针头滤器过滤后分装，每支500μl，于-80℃冰箱保存。同时补加6ml新的含10％fbs的dmem培养基，在转染后72h，收集所有上清，并过滤分装后冻存。2)逆转录病毒感染vero细胞：于6孔板每孔中接种2×10⁵个vero细胞，使第二天细胞密度达到约40％；将收集的转染后48h的逆转录病毒上清加入polybrene，使其终浓度为8μg/ml，室温孵育10-15min，每孔中加入1ml病毒液，在37℃培养箱中放置2-3h后换成2ml含10％fbs的dmem培养基，于感染后24h，弃培养基，用收集的72h的逆转录病毒上清再次感染细胞，感染方法同前。3)表达wnvns1蛋白的细胞系筛选：在逆转录病毒二次感染48h后，每孔中添加新鲜的含终浓度为5μg/ml嘌呤霉素(puromycin)的10％fbs+dmem培养基，每三天更换新鲜的含嘌呤霉素的培养基，除去未获得抗性基因的细胞，直至剩余细胞成团簇生长，将细胞用pbs洗一次后，用浸润胰酶的滤纸片放在六孔板肉眼可看到细胞团上，消化1min，迅速放入含终浓度为5μg/ml嘌呤霉素的10％fbs+dmem培养基的24孔板中，扩大培养，每三天更换含嘌呤霉素的培养基，将单克隆细胞依次扩大到6孔板和t25细胞培养瓶中。4)表达wnvns1蛋白的细胞系表达量验证：通过间接免疫荧光实验鉴定出ns1表达量较高的单克隆细胞株：将单克隆细胞株按2×10⁵个接种于35mm细胞培养皿中，每个皿中放3张玻片，于第二天收取玻片，加入1mlpbs，重复洗3次，每孔加入1ml-20℃预冷的5％丙酮(溶于甲醇)固定液，室温固定15min；弃固定液，用1mlpbs洗3次，将每孔中的玻片取出孵育一抗，抗体为1:500倍稀释的兔源的ha-tag(cst)单克隆抗体；室温孵育一抗1h后，pbs洗10遍；于室温避光孵育二抗，抗体为1:125倍稀释的偶联异硫氰酸荧光素(fitc)羊抗兔抗体(proteintech)；二抗孵育1h后，pbs洗10遍，取出载玻片，做好标记，每个标记处，点一小点95％甘油，将盖玻片有细胞面朝下，置于甘油滴上，于荧光显微镜下进行观察，确定每株细胞的阳性率。5)表达wnvns1蛋白的细胞系互补缺失非结构蛋白ns1基因的wnv克隆产生wnv-δns1复制缺陷病毒水平验证：将上一步鉴定的阳性率较高的细胞株按2×10⁵个接种于35mm细胞培养皿中，每个皿中放3张玻片，于第二天分别转染1μg体外转录得到的wnv-δns1的rna，转染方法同实施例2中wnv-δns1病毒拯救。分别于转染后24/48/72h各收取一张玻片，利用1:500倍稀释的鼠源的抗e蛋白的4g2单克隆抗体为一抗，1:125倍稀释的fitc羊抗鼠抗体(proteintech)为二抗进行间接免疫荧光检测，方法同上。通过wnve蛋白阳性细胞扩增情况反应wnv-δns1病毒扩增情况，同时收取72h病毒上清，测定wnv-δns1缺陷病毒滴度，方法同实施例2中wnv-δns1病毒滴度测定。选择互补产出复制缺陷病毒扩增较快，滴度最高的细胞株作为种子细胞系，并进行大量扩增冻存。

细胞系筛选完毕，会得到不止一株ns1表达量高的细胞系，我们通过比较这几株细胞系反式互补缺失非结构蛋白ns1基因的克隆产生复制缺陷病毒的水平，选择最优的细胞系作为种子细胞系，同时传代过程中通过加入嘌呤霉素使ns1基因不丢失，且细胞系筛选鉴定后即进行大量冻存。

该细胞系的培养特性是带有嘌呤霉素抗性基因，可以在含有终浓度为5μg/ml嘌呤霉素的培养基中正常生长。后续的细胞系培养，为了保证其稳定性，使用含有终浓度为5μg/ml嘌呤霉素的10％fbs+dmem培养基，于37℃，5％co2培养箱中培养。

申请人已于2019年5月20日将该细胞系的第5代送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：非洲绿猴肾细胞vero/wnv-ns1，保藏编号：cctccno:c2019113，地址：中国武汉武汉大学。

本发明将非洲绿猴肾细胞vero/wnv-ns1简称为verons1。

实施例2：

一种复制缺陷西尼罗病毒的制备方法，包括下述步骤：

1.wnv-δns1复制缺陷病毒拯救：体外转录得到的wnv-δns1的rna使用脂质体转染的方法转染于ns1表达细胞系verons1和293tns1(对照)：于转染前一天，分别接种2×10⁵个verons1以及5×10⁵个293tns1细胞于35mm细胞培养皿中，使细胞在转染当天达到约80％；转染时，先弃培养皿中培养基，用1mlopti-mem洗一次，再加1mlopti-mem(使细胞处于浸润状态)；于1.5mlep管中加入1mlopti-mem，加4μldmrie-c(invitrogen)(dmrie-c用前先混匀)先上下颠倒混匀，再分别加入1μg体外转录得到的wnv-δns1的rna，上下颠倒混匀；迅速弃培养皿中opti-mem，将混匀物加入皿中(动作要轻，勿对着细胞吹打)；于37℃co2培养箱中培养4h后，弃培养物，再各加2ml含2％fbs的dmem培养基。分别于转染72h收集病毒上清，得到wnv-δns1复制缺陷病毒，于-80℃保存，缺陷病毒拯救过程示意图如图2中a所示。

2.wnv-δns1复制缺陷病毒滴度测定：在24孔细胞培养板的各孔中分别接种1×10⁵个verons1细胞，每孔中放一个玻片，待细胞汇合度达到90％时，弃孔中的培养基，每孔加入100μl用含2％fbs的dmem培养基10倍比稀释的上述步骤1收集的缺陷病毒，37℃培养箱吸附1h，每15min充分晃动一次。吸附完毕后将各个孔的病毒液吸弃，加入1ml含有2％甲基纤维素的覆盖物，于37℃，5％co2的培养箱中培养36h后收玻片进行间接免疫荧光(ifa)检测：弃去甲基纤维素，加入1mlpbs，重复洗3次，每孔加入1ml-20℃预冷的5％丙酮(溶于甲醇)固定液，室温固定15min；弃固定液，用1mlpbs洗3次，将每孔中的玻片取出孵育一抗，抗体为1:500倍稀释的鼠源的抗e蛋白的4g2单克隆抗体；室温孵育一抗1h后，pbs洗10遍；于室温避光孵育二抗，抗体为1:125倍稀释的偶联异硫氰酸荧光素(fitc)羊抗鼠抗体(proteintech)；二抗孵育1h后，pbs洗10遍，取出载玻片，做好标记，每个标记处，点一小点95％甘油，将盖玻片有细胞面朝下，置于甘油滴上，于荧光显微镜下进行观察，确定抗e蛋白荧光细胞团的个数，进一步确定缺陷病毒滴度。

缺陷病毒滴度表示形式为ffu/ml，滴度计算公式如下：滴度(ffu/ml)＝n×10n×10×(sw/sia)。(n：单个玻片视野下抗e蛋白阳性细胞团个数；10n：稀释倍数；10：每毫升与感染24孔板的病毒液体积100μl的比值；sw：24孔板的表面积；sia：玻片面积)

用verons1细胞系拯救的复制缺陷病毒滴度是：1.4×10⁸ffu/ml；用293tns1细胞系拯救的复制缺陷病毒滴度是：2.5×10⁴ffu/ml。

3.wnv-δns1复制缺陷病毒于verons1和293tns1两种细胞系以及有血清的dmem培养基和无血清的vp-sfm培养基上的生长曲线比较：

于两个35mm细胞培养皿中分别接种2×10⁵个verons1以及5×10⁵个293tns1细胞，在37℃，5％co2培养条件下，待汇合度达到60％时，按照感染复数moi为0.1，分别向每个皿中加入400μl稀释后的wnv-δns1缺陷病毒，37℃，5％co2培养箱中吸附2h后，弃病毒液，每皿中加入2ml含2％血清的dmem培养基，于37℃，5％co2培养条件下培养，分别于感染后24/36/48/72h收400μl病毒上清并补加400μl含2％血清的dmem培养基，收集的病毒于-80℃保存。按照上述缺陷病毒滴度测定方法测定不同时间点收集的病毒滴度，绘制生长曲线。结果如图2中b，表1所示：wnv-δns1复制缺陷病毒于verons1细胞系上较293tns1细胞系生长好，且在感染后48h病毒即可达到最高滴度约2×10⁸ffu/ml，而在293tns1细胞系上最高滴度只能达到约10⁵ffu/ml，说明筛选的ns1表达细胞系verons1较293tns1更适用于wnv-δns1复制缺陷病毒的生长，从而有利于后续疫苗的生产。

表1wnv-δns1复制缺陷病毒于verons1和293tns1两种细胞系上按相同感染复数感染后不同时间点的病毒滴度

同上，于两个35mm细胞培养皿中分别接种2×10⁵个verons1细胞，按照感染复数moi为0.1，分别向每个皿中加入wnv-δns1缺陷病毒，吸附2h后，弃病毒液，每皿中分别加入2ml含2％血清的dmem培养基以及无血清的vp-sfm培养基，分别于感染后24/36/48/72h收病毒上清测病毒滴度，绘制生长曲线。结果如图2中c，表2所示，wnv-δns1复制缺陷病毒于无血清的vp-sfm培养基中培养，能达到与在有血清的dmem培养条件下相似的高滴度病毒。

表2wnv-δns1复制缺陷病毒于2％血清的dmem培养基和无血清的vp-sfm培养基中按相同感染复数感染后不同时间点的病毒滴度

以上结果表明，发明所筛选的ns1表达细胞系verons1为后续疫苗的生产提供了便利，并节约了成本。

实施例3：

本发明拯救的wnv-δns1复制缺陷病毒与wnv野生型病毒wt在生长曲线、免疫噬斑形态、结构蛋白大小以及免疫原性上的比较：

1.wnv-δns1复制缺陷病毒与wnv野生型病毒wt生长曲线比较：同实施例1，于两个35mm细胞培养皿中分别接种2×10⁵个verons1细胞，按照感染复数moi为0.1，分别向每个皿中加入wnv-δns1缺陷病毒以及wnv野生型病毒wt，吸附2h后，弃病毒液，每皿中分别加入2ml含2％血清的dmem培养基，分别于感染后24/36/48/72h收病毒上清，按照实施例1中方法测定测病毒滴度，绘制生长曲线(图3中a)。结果表明，wnv-δns1复制缺陷病毒与野生型病毒wt在生长趋势相似。

2.wnv-δns1复制缺陷病毒与wnv野生型病毒wt免疫噬斑形态比较：在24孔细胞培养板的各孔中分别接种1×10⁵个verons1细胞，待细胞汇合度达到90％时，弃孔中的培养基，加入100μl分别用含2％fbs的dmem培养基10倍比稀释的wnv-δns1以及wt病毒，37℃吸附1h，每15min充分晃动一次。吸附完毕后将各个孔的病毒液吸弃，加入1ml含有2％甲基纤维素的覆盖物，于37℃,5％co2的培养箱中培养36h，弃去甲基纤维素，加入1mlpbs，重复洗3次，每孔加入1ml-20℃预冷的固定液(甲醇：丙酮＝1：1)，室温固定15min；弃固定液，用1mlpbs洗3次；每孔加入200μl1:500倍稀释的4g2单克隆抗体；室温孵育一抗1h后，pbs洗3遍；于室温每孔加入200μl1:500倍稀释的辣根过氧化物酶(hrp)羊抗鼠抗体(proteintech)；二抗孵育2h后，pbs洗3遍，用增强型hrp-dab底物显色试剂盒(天根)避光进行显色。观察噬斑形态(图3中b)。从图中可以看到，wnv-δns1复制缺陷病毒具有与野生型病毒wt类似的噬斑形态。

3.wnv-δns1复制缺陷病毒与wnv野生型病毒wt浓缩及纯化：于175-cm²的培养瓶中接种3×10⁶个verons1细胞，待细胞汇合度达到60％时，按照感染复数moi为0.1，分别向每个瓶中加入wnv-δns1以及wt(每种病毒培养4瓶)，于感染后48h，分别收上清。于4℃，400g离心10min取上清，再于4℃，5000rpm离心20min取上清以去除细胞及碎片。向上清中加入终浓度为8％(w/v)的peg8000(sigma)，上下颠倒混匀后于4℃沉淀过夜，并于4℃，10500g离心50min后弃上清，将沉淀用pbs进行溶解。于超离管中铺用pbs配制的浓度为24％(w/v)的蔗糖垫，将溶解后的病毒铺在蔗糖垫上面，用optimamax-xp超速离心机，sw41转头，于4℃，105000g离心1.5h，弃上清，沉淀溶解于50μlpbs中，于-80℃保存备用，浓缩纯化后的病毒滴度是：1.2×10⁹ffu/ml。

4.wnv-δns1复制缺陷病毒与wnv野生型病毒wt结构蛋白大小比较：分别将上述超离纯化后的wnv-δns1以及wt病毒制备蛋白样，进行sds-page后用考马斯亮蓝进行染色，两种病毒中均能看到一条大小约55kda和15kda的条带(图3中c)，分别与wnv结构蛋白e蛋白和capsid蛋白的分子量一致。用病毒e蛋白特异性单克隆抗体4g2以及capsid蛋白特异性多克隆抗体进行westernblotting检测，均能检测到e蛋白和capsid蛋白条带(图3中d)。结果表明wnv-δns1复制缺陷病毒与野生型病毒wt的结构蛋白相同，大小一致。

5.wnv-δns1复制缺陷病毒与wnv野生型病毒wt免疫原性比较：用噬斑减少中和实验(prnt50)分别检测fd011-1和fd011-2两种wnve蛋白特异性单克隆中和抗体对wnv-δns1以及wt的中和效果。具体的，在12孔细胞培养板的各孔中接种2×10⁵个verons1细胞，每孔中放一个玻片，待细胞汇合度达到90％时，先将fd011-1和fd011-2两种单抗进行2倍系列稀释，分别将100μl稀释后的抗体与等体积的100ffuwnv-δns1以及wt混匀后于37℃孵育1h(两种单抗的终浓度均为：1.6/0.8/0.4/0.2/0.1/0.05/0μg/ml)；弃孔中的培养基，将孵育后的抗体-病毒混合物加入对应孔中，37℃吸附1h，每15min充分晃动一次；吸附完毕后将各个孔的病毒液吸弃，加入1ml含有2％甲基纤维素的覆盖物，于37℃，5％co2的培养箱中培养36h后收玻片进行间接免疫荧光(ifa)检测每孔中抗e蛋白荧光细胞团的个数，并计算每种稀释浓度下的单抗对wnv-δns1以及wt的抑制率：抑制率(％)＝1-单抗中和后的病毒中抗e蛋白荧光细胞团的个数/未被单抗中和的病毒中抗e蛋白荧光细胞团的个数。

结果表明fd011-1(图4中a)和fd011-2(图4中b)两种单抗对wnv-δns1以及wt病毒的中和效果具有相似的剂量依赖性，说明wnv-δns1复制缺陷病毒与野生型病毒wt具有相同的免疫原性。

实施例4：

wnv-δns1复制缺陷病毒稳定性与安全性检测：

1.wnv-δns1复制缺陷病毒具有遗传稳定性：将实施例2中拯救得到的wnv-δns1病毒作为p0代，在verons1细胞中进行连续传代至p15代，分别将等量的p5/p10/p15代病毒上清同时感染verons1和普通的vero细胞，进行ifa实验(图5中a)。如图所示，不同代数上清感染的verons1细胞均能检测到类似的较多的阳性细胞，而vero细胞中一直未检测到阳性细胞，表明wnv-δns1病毒在传代过程中稳定，未发生重组，具有很好的遗传稳定性。

2.wnv-δns1复制缺陷病毒安全性：在12孔细胞培养板的各孔中分别接种2×10⁵个verons1细胞以及vero细胞，待细胞汇合度达到60％时，按照感染复数moi为100，分别向每孔中接种wnv-δns1-gluc报告病毒(以本实验室已有的pacyc-wnv-gluc报告病毒克隆(将报告基因gluc插入至5’utr和capsid之间)为骨架，将ns1基因的4-298位氨基酸进行缺失，得到pacyc-wnv-δns1-gluc，构建过程同实施例1中pacyc-wnv-δns1)，分别于感染后0/1/2/4/6/8/12/24/36h按照pierce^tmgaussialuciferaseflashassaykit(thermoscientific)说明书裂解孔中细胞，用多功能酶标仪varioskanflash(thermofisher)检测gluc信号值，并绘制曲线(图5中b)。

如图所示，在感染后的1至6h两种细胞中的verons1细胞相似且有一定的增长，表明此阶段为wnv-δns1-gluc病毒的翻译时期。在感染后的8至36h，verons1细胞中的gluc信号值明显增长，表明wnv-δns1-gluc病毒在verons1细胞中正常复制，而vero细胞中的gluc信号值逐渐降低，表明wnv-δns1-gluc病毒不能在vero细胞中复制，进一步说明wnv-δns1具有复制缺陷，只能在ns1表达细胞系verons1细胞系中复制，在细胞水平上具有安全性。

为了进一步在动物水平上验证wnv-δns1复制缺陷病毒的安全性，分别将10²ffu的wnv-wt和2×10⁸ffu的wnv-δns1病毒腹腔接种六周龄的雌性ifnar-/-小鼠(i型干扰素缺陷且对wnv病毒感染敏感)，每组五只小鼠。每天观察小鼠的生存情况，共监测28天并绘制生存曲线(图5中c)。结果表明接种了wnv-δns1病毒的小鼠均存活，且未见发病迹象，而接种了wnv-wt的小鼠于第5天全部死亡，且从第2天开始小鼠即表现出毛不顺、体重下降等发病现象。证明wnv-δns1病毒在ifnar-/-小鼠中不致病，具有很高的安全性，可以作为一种潜在的候选疫苗。

实施例5：

本发明的制备方法制备出的wnv-δns1病毒在制备疫苗中的的应用：

本实施例考察的是wnv-δns1病毒在c57bl/6小鼠模型中加强免疫后体液免疫效果评价：

1.三组四周龄的雌性c57bl/6小鼠(每组五只)，分别腹腔免疫4.8×10⁷ffu的wnv-δns1病毒和等体积的pbs,以及不做任何处理的mock组。于免疫后28天按相同剂量进行加强免疫，分别于第一次免疫和加强免疫后的14天和28天取血，于4℃静置3h后离心收取血清，56℃灭活30min，-20℃冻存备用。

分别用elisa检测igg抗体滴度以及prnt50检测中和抗体滴度：1)用wnv-δns1病毒包被96孔板，并用pbs配制的5％脱脂牛奶进行封闭，将血清从1:50开始进行4倍系列稀释后与包被后的96孔板于37℃孵育2h，pbst洗板3次后于37℃孵育hrp羊抗鼠抗体1h，用双组分显色试剂盒(proteintech)进行显色，加入1mh2so4进行终止后，用多功能酶标仪检测在450nm下的吸光值，igg抗体滴度为当免疫后的小鼠血清吸光值为未免疫小鼠血清吸光值的2倍时的最高稀释度(图6中b)。2)在12孔细胞培养板的各孔中分别接种2×10⁵个bhk-21细胞，待细胞汇合度达到90％时，先将血清进行2倍系列稀释，分别将100μl稀释后的抗体与等体积的100pfuwnv-wt混匀后于37℃孵育1h；弃孔中的培养基，将孵育后的血清-病毒混合物加入对应孔中，37℃吸附1h，每15min充分晃动一次；吸附完毕后将各个孔的病毒液吸弃，加入1ml含有2％甲基纤维素的覆盖物，于37℃，5％co2的培养箱中培养72h，待噬斑形成后用含有1％结晶紫和3.7％甲醛的染色液染色，室温处理30min后，取出孔中的染色液，并用流水冲洗孔底，烘干后即可计数每种稀释度下血清中和后病毒滴度，血清的中和抗体滴度(prnt50)为当病毒滴度被中和50％时血清的最高稀释度(图6中c)。结果表明c57bl/6小鼠在初次免疫wnv-δns1后14d即可产生较强的抗体反应，且igg抗体滴度不断增加，在加强免疫后滴度达到最高，约1:10000。中和抗体滴度检测结果与igg抗体滴度增长趋势一致，加强免疫后中和抗体滴度较初次免疫后28d的滴度提高了约16倍，滴度约1:1280-1:2560。证明wnv-δns1免疫c57bl/6小鼠后可产生较强的针对wnv的抗体反应。

2.于加强免疫后30d，除mock组不做任何处理，其余二组小鼠分别腹腔攻毒3×10⁷pfuwnv-wt。每天记录小鼠的生存情况并称量体重，共测量28天，同时于攻毒后的第2d，眼眶取血，用real-timepcr方法检测毒血：每只小鼠取5滴血于1.5mlep管中，分别加入1mltrizol进行充分裂解，按照说明书进行rna提取。用onestepsybrprimescriptplusrt-pcrkit(perfectrealtime)(购于takara公司)进行real-timert-pcr检测，引物为wnv-f:5’-tacaacatgatgggaaagcgagagaaaaa-3’和wnv-r:5’-gtgtcccagccggcggtgtcatcagc-3’。反应体系均为：反转录42℃5min，预变性95℃10s，pcr40个循环包括变性95℃5s，退火和延伸60℃30s。结果表明免疫pbs的对照组小鼠在进行攻毒后第6d开始出现了体重逐渐下降(图6中d)，攻毒后第2d可检测到较高的毒血水平(图6中f)，表现出发病症状如毛不顺、后肢麻痹等，并于第15d全部死亡(图6中e)。而免疫了wnv-δns1的小鼠与不做任何处理的mock组小鼠均存活，未出现任何发病症状，且未检测到毒血。同时检测免疫了wnv-δns1的小鼠在攻毒后14d和28d的igg抗体滴度(方法同上)，抗体滴度增加(图6中g)表明wnv病毒成功感染免疫后的小鼠。证明本发明所拯救的wnv-δns1复制缺陷病毒在c57bl/6小鼠模型中确定是安全的，并且可以作为疫苗对c57bl/6小鼠提供良好的免疫保护。

实施例6：

本发明提供的wnv-δns1病毒在制备疫苗中的的应用：

本实施例考察的是wnv-δns1病毒在c57bl/6小鼠模型中单次免疫不同剂量后体液免疫效果及攻毒保护效果评价：

1.五组四周龄的雌性c57bl/6小鼠(每组五只)，分别腹腔免疫3×10⁶、1.2/4.8×10⁷ffu的wnv-δns1病毒和等体积的pbs，以及不做任何处理的mock组。分别于免疫后的14天和28天取血，elisa检测igg抗体滴度(图7中b)以及prnt50检测中和抗体滴度(图7中c)(方法同实施例5)。结果表明不同剂量的wnv-δns1免疫c57bl/6小鼠后14d均能产生抗体反应，且28d时抗体滴度均有提高，中和抗体滴度检测结果与抗体滴度增长趋势一致。证明单次免疫wnv-δns1即可使c57bl/6小鼠产生较强的针对wnv的抗体反应。

2.于免疫后30d，除mock组不做任何处理，其余四组小鼠分别腹腔攻毒3×10⁷pfuwnv-wt。每天记录小鼠的生存情况并称量体重，共测量15天，同时于攻毒后的第2d，眼眶取血，用荧光定量pcr方法检测毒血(方法同实施例5)。结果表明免疫pbs的对照组小鼠在进行攻毒后第7d体重急剧下降并全部死亡(图7中d和e)，攻毒后第2d可检测到较高的毒血水平(图7中f)，表现出发病症状如毛不顺、后肢麻痹等。而免疫了不同剂量的wnv-δns1的小鼠与不做任何处理的mock组小鼠均存活，未出现任何发病症状且未检测到毒血。同时检测免疫了不同剂量的wnv-δns1的小鼠在攻毒后14d和28d的igg抗体滴度(图7中g)(方法同实施例5)，抗体滴度增加表明wnv病毒成功感染免疫后的小鼠。证明本发明所拯救的wnv-δns1复制缺陷病毒单次低剂量免疫即可对c57bl/6小鼠提供很好的免疫保护，具有作为候选疫苗的潜能。

实施例6：

本发明提供的wnv-δns1病毒在制备疫苗中的的应用：

本实施例考察的是wnv-δns1病毒在c57bl/6小鼠模型中加强免疫后细胞免疫效果评价：

四组四周龄的雌性c57bl/6小鼠(每组五只)，二组腹腔免疫19.2×10⁷ffu的wnv-δns1病毒，二组不做任何处理作为mock组。于免疫后28天按相同剂量进行加强免疫，分别于加强免疫后的7天和14天取免疫组和mock组小鼠的脾脏，通过流式细胞术检测cd8⁺ifn-γ⁺t细胞增殖情况：摘取脾脏，于无血清rpmi-1640培养基内洗两遍；用200目金属研磨网进行研磨，离心后取脾细胞沉淀用1×红细胞裂解液室温裂解5min；离心后加入含有β-巯基乙醇的1640培养基悬浮细胞，调整细胞浓度为2×10⁷cells/ml；分别用1μg/ml的wnve蛋白多肽以及50ng/ml的pma+1μg/ml的iono在37℃刺激淋巴细胞5h，刺激同时加入1μl/ml的golgiplug；刺激后的细胞用含2％fbs的pbs染色缓冲液洗后，加入anti-cd8⁺抗体(mscd8aapc-cy7，bdpharmingen)于4℃染色30min；细胞用染色缓冲液洗后加入细胞固定穿膜液于4℃处理20min；细胞用穿膜漂洗缓冲液洗后，加入anti-ifn-γ抗体(msifn-gmape-cy7，bdpharmingen)于4℃染色30min；细胞用穿膜漂洗缓冲液洗后重悬于染色缓冲液，即可进行流式细胞术检测。如图8中a所示，加强免疫后7d至14d，小鼠cd8⁺ifn-γ⁺t细胞的活化呈现增长趋势。加强免疫后14d，经wnve蛋白多肽以及pma+iono刺激后的cd8⁺ifn-γ⁺t细胞分别从刺激前的0.2％增长至1％和3.2％，而未免疫的mock组经wnve蛋白多肽刺激后的cd8⁺ifn-γ⁺t细胞与刺激前水平一致，经pma+iono刺激后从刺激前的0.2％略微增长至1％(图8中b)。表明本发明所拯救的wnv-δns1复制缺陷病毒加强免疫c57bl/6小鼠后可产生较强的针对wnve蛋白表位特性cd8⁺ifn-γ⁺t细胞反应。

序列表

<110>中国科学院武汉病毒研究所

<120>一种复制缺陷西尼罗病毒的制备方法及应用

<160>7

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>10149

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

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