一种大豆原生质体的制备和转化方法与流程

本发明涉及植物基因工程技术领域，尤其涉及一种大豆原生质体的制备和转化方法。

背景技术：

原生质体在遗传操作、种质资源育种等研究有诸多优点，但大多数植物原生质体技术的应用均以高效的原生质体分离体系为基础，即如何获得高活力、高产量的原生质体。目前peg介导的瞬时转化是检测基因功能的一种通用工具，具有低成本、转化率高、时间短、无基因型限制等优点，建立高效、快速、准确的peg瞬时转化体系，有助于解决大豆难以转化的问题，对大豆基因组高通量分析的研究具有战略性的意义。

大豆原生质体制备已有方法为采用1％纤维素酶加0.1％果胶酶的酶解液制备大豆幼嫩子叶的原生质体，产量为1×10⁶个/g，而利用peg进行大豆原生质体转化效率仅为0.27％-0.4％。

因此，本领域的技术人员致力于开发一种快速高效的原生质体的制备和转化方法，克服大豆原生质体不易制备和转化的困难，提高其原生质体的产量和转化率，更有助于鉴定大豆基因功能。并进一步为其他植物、其他部位的原生质体的制备和转化条件探索提供可靠的依据。

技术实现要素：

有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是如何提供一种快速高效的原生质体的制备和转化方法，克服大豆原生质体不易制备和转化的困难，提高其原生质体的产量和转化率。

为实现上述目的，本发明提供了一种大豆原生质体的制备方法，所述方法包括以下步骤：

步骤一、挑选饱满大豆幼荚，消毒后，剥出幼胚，除去种皮，将所述幼胚近轴端接于d40培养基，在恒温条件25-26℃，16h/8h，300μmol·m^-2·s^-1下培养25-35天，诱导出直径2.5-3.5mm体细胞胚后转入d20培养基中培养15-25天，不断转入新鲜配置的d20培养基中继代培养，获得胚性愈伤；

步骤二、将所述步骤一中得到的胚性愈伤，除去粘结的培养基部分，并分开成一个个的颗粒状后，加入酶溶液，进行酶解反应；

步骤三、用200目的尼龙网细胞筛过滤所述酶解反应后的混合物，将得到的滤液以800r·min^-1离心5min后，除去上清液，并加入10mlw5溶液冲洗2次，得到粗纯后的原生质体；

步骤四、向所述步骤四中得到的所述粗纯后的原生质体中加入5mlw5-23％溶液，以800r·min^-1离心5min后，除去上清液，并用w5溶液重悬所得到的纯化后的原生质体。

进一步地，所述步骤一中得到的所述胚性愈伤为继代培养5次得到的。

进一步地，所述酶溶液为2％纤维素酶、0.1％果胶酶、1％离析酶和mes溶于w5溶液中配制成的混合液，ph为5.8。

进一步地，所述步骤二中的所述酶解反应的条件为密封、避光，温度25-26℃，于50r·min^-1摇床上反应。

进一步地，所述步骤二中所述胚性愈伤与所述酶溶液的加入比例为：每0.2g所述胚性愈伤加入5ml所述酶溶液。

进一步地，所述胚性愈伤可用切成细条状的大豆发芽14天后第一片三出复叶代替，进行所述酶解反应。

本发明还提供了一种大豆原生质体的转化方法，所述方法包括以下步骤：

步骤a、将待转化的原生质体密度调节为5×10⁶个/ml，待所述原生质体沉淀后，除去上清液，用mmg悬浮液重悬所述原生质体，调节成密度为2.5×10⁶个/ml的原生质体混合液，室温静置；

步骤b、将所述步骤a中得到的所述原生质体混合液按照每0.1ml与0.01ml质粒轻柔混匀，再加入0.11mlpeg溶液，并立即颠倒混匀，室温静置后，加入0.4mlw5溶液，轻柔颠倒混匀终止转化反应，室温下离心2min，除去上清液，得到离心产物；

步骤c、将所述步骤b中得到的所述离心产物用wi溶液重悬，并转移到事先用含0.1％bsa的wi溶液清洗过的培养皿中，避光室温放置24h。

进一步地，所述质粒的浓度为1.5μg/μl。

进一步地，所述peg溶液为浓度为30％的peg4000溶液。

进一步地，所述步骤b中加入所述peg溶液后，所述室温静置时长为10min。

与现有技术相比，本发明至少具有以下有益的技术效果：

(1)本发明提供的方法能够通过快速的酶解反应获得大量的原生质体，提高了大豆原生质体的产量；

(2)本发明提供的方法能够快速、高效、准确地转化大豆原生质体，显著提高了大豆原生质体的转化率，有效地解决了其难以转化的问题；

(3)本发明提供的方法不仅有助于鉴定大豆基因功能，更为其他植物、其他部位的原生质体的制备和转化条件探索提供了可靠的依据。

以下将结合附图对本发明的构思、具体方法及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。

附图说明

图1是本发明的一个较佳实施例中酶解后得到的有活力的大豆原生质体经fda染色后的荧光图片；

图2是本发明的一个较佳实施例中大豆原生质体转化结果图片。

具体实施方式

以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。

实施例中，使用的溶液组成如下：

d40培养基：蔗糖30g·l-1，2,4-d40mg·l^-1，琼脂2g·l^-1。

d20培养基：蔗糖30g·l-1，2,4-d20mg·l^-1，琼脂2g·l^-1。

w5溶液：mes2mm，cacl2125mm，nacl154mm，kcl5mm，ddh2o溶解，ph＝5.7。

w5-23％：附加23％蔗糖的w5溶液。

mmg溶液：mes4mm，mannitol0.4m，mgcl215mm，ddh2o溶解，ph＝5.7。

wi溶液：mannitol0.5m，kcl20mm，ddh2o溶解，ph＝5.7。

peg溶液：peg400030％(wt/vol)，mannitol0.2m，cacl2100mm，ddh2o溶解。

酶溶液：2％纤维素酶，0.1％果胶酶，1％离析酶，溶于w5溶液，再加入mes调节溶液ph维持在5.8。

实施例1

大豆胚性愈伤的诱导及原生质体的制备：

1)采摘大豆开花后14天的饱满幼荚，无菌水冲洗3-4遍，除去表面的杂质；

2)将所述幼荚完全浸泡在20％的次氯酸钠溶液中，于摇床(180r/min，25)℃震荡消毒20分钟后，用无菌水冲洗2-3遍；

3)用灭菌的镊子和手术刀将所述幼荚的幼胚剥出，并除去种皮；

4)将所述幼胚的近轴端接于d40培养基中，恒温(25-26，℃16h/8h，300μmol·m^-2·s^-1)诱导30天；

5)选取直径约3mm的体细胞胚转入d20培养基中培养20天；

6)待所述体细胞胚长至0.8-1mm大小后，转入新鲜配置的d20培养基中继代培养5次，获得高活力、性状稳定的胚性愈伤；

7)选取继代培养后质地坚硬的颗粒状愈伤，用无菌的手术刀和镊子小心除去愈伤组织粘结的培养基部分，用手术刀将脆性的愈伤尽量分开成一个个的颗粒状以便充分与酶溶液接触，每个样取0.2g；

8)将0.2g胚性愈伤加入到5ml酶溶液中，封口并于避光、温度25-26、℃50r·min^-1的条件下酶解5h；

9)用尼龙网细胞筛(200目)过滤酶解后混合溶液，将滤液转入离心管中800r·min^-1离心5min，尽可能地小心吸取上清液，加入10mlw5溶液冲洗2次，得到粗纯后的原生质体；

10)向所述粗纯后的原生质体中加入5mlw5-23％溶液，800r·min^-1离心5min，用移液枪小心地将原生质体带尽可能吸出，用w5溶液重悬，得到纯化的原生质体。

实施例2

大豆叶片原生质体的制备：

1)选取大豆发芽14天后的第一片三出复叶，用无菌水冲洗叶片表面除去杂质；

2)用手术刀和镊子将所述叶片切成0.5mm的细条状以便充分与酶溶液接触，每个样取0.2g左右；

3)将0.2g条状叶片加入到5ml混合酶解液中，封口并于避光、温度25-26、℃50r·min-1的条件下酶解5h；

4)用尼龙网细胞筛(200目)过滤酶解液，将滤液转入离心管中800r·min^-1离心5min，尽可能地小心吸取上清液，加入10mlw5溶液冲洗2次，得到粗纯后的原生质体；

5)向所述粗纯后的原生质体中加入5mlw5-23％溶液，800r·min^-1离心5min，用移液枪小心地将原生质体带尽可能吸出，用w5溶液重悬，得到纯化的原生质体；

6)原生质体产量和活力鉴定：吸取20μl纯化后的原生质体悬浮液滴在血球计数板(25×16)中央计数室内，待悬浮液静止后，在光学显微镜下统计原生质体数量。1ml原生质体悬浮液中加入1μlfda溶液，静置5-10min，吸取1滴于载玻片上，在荧光显微镜下观察，统计发绿色荧光的原生质体占总原生质体数量的百分比。

本实施例中制备的大豆原生质体经fda染色后的荧光图片如图1所示。通过本发明提供的方法，制备出了结构完整、具有活力的原生质体，证明了本发明提供的制备方法以及优化的酶溶液进行酶解的可行性。且计算得到的原生质体产量达到了3.6×10⁶个/g，相较于现有技术具有显著提高。

实施例3

大豆叶片原生质体的转化：

1)用w5溶液调节叶片原生质体悬浮液密度为5×10⁶个/ml，置于冰上1h，待所述原生质体沉淀在试管底部后，用移液枪小心尽可能吸取上清，用mmg悬浮液重悬所述原生质体，密度调节至2.5×106个/ml，室温静置；

2)准备6-10个无菌离心管，每个试管分别加入0.1ml所述原生质体的重悬液、0.01ml质粒、0.11ml浓度为30％的peg4000溶液，其中所述质粒浓度为1.5μg/μl，立即颠倒混匀，在室温中静止10min；

3)之后再向每个离心管加入0.4mlw5溶液，轻柔颠倒离心管混匀以终止转化反应，200g/min的转速在室温下离心2min，除去上清液；

4)用1mlwi溶液重悬所述原生质体，转移到事先用含0.1％bsa的wi溶液清洗过的培养皿中，避光室温放置24h；

5)以100g/min的转速离心2min，分别收集每个培养皿中的所述原生质体的溶液，吸去上清液，用yfp染色，在荧光显微镜(488-514nm)下观察计算原生质体转化率。

本实施例中制备的大豆原生质体转化结果图片如图2所示。通过本发明提供的方法进行转化后，具有发红色荧光的叶绿体的原生质体中，能够观察到黄色荧光蛋白yfp发光，证明了本发明提供的peg转化方法及优化的试剂配比的可行性。且计算得到的转化率达到20％，相较于现有技术具有显著提高。

通过上述实施例中的荧光图片观察以及统计计算结果可以看出通过本发明提供的大豆原生质体的制备和转化方法得到的原生质体的产量和转化率相较于现有技术都具有显著的提高。这主要是由于本发明中对酶溶液的优化，使得对胚性愈伤或大豆叶片组织的酶解速率及效果大大提升，能够快速、高效地获得更多地原生质体。再加上本发明提供的原生质体的转化方法中选取了优化的质粒及peg溶液的浓度和加入比例，以及更高效的操作过程，使得大豆原生质体的转化率大大提高，解决了大豆原生质体转化困难的问题。本发明不仅提供了一种快速高效的原生质体制备和转化的方法，有助于鉴定大豆基因功能，并进一步为其他植物、其他部位的原生质体的制备和转化条件探索提供了可靠的依据。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。