一种提高鼠李糖乳杆菌富硒效果的培养方法与流程

本发明属于生物领域，具体地说，公开了一种提高鼠李糖乳杆菌富硒效果的培养方法。

背景技术：

硒是人体必需的微量元素，目前发现的硒蛋白大约35种，硒是甲状腺素脱碘酶(id)、硫氧还蛋白还原酶(trxr)、硒磷酸酯合成酶(sps)和谷胱甘肽过氧化物酶(gpx)等酶活性中心的组成成分，具有保护人体细胞膜的结构和功能免受过度氧化损伤，抗癌、解毒、保肝和提高人体免疫力的生理功能。有机硒的毒性比无机硒小，且生物活性较高，能够有效地在人体内同化，有利于在体内吸收。因而人工补充有机硒已受到国内外有关专家的广泛关注。由于人工合成有机硒技术难度大，成本高，因而不少学者对利用动植物、微生物的转化作用获取有机硒进行了研究。乳酸菌具有将无机硒生物转化成有机硒的功能，相对于人工转化而言，既便宜又安全。但富硒量偏低，所以研究能够促进乳酸菌富硒效果的方法极为重要。

技术实现要素：

针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种提高鼠李糖乳杆菌富硒效果的培养方法，提高了乳酸菌对硒的富集作用。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种提高鼠李糖乳杆菌富硒效果的培养方法，包括如下步骤：

步骤1，将冻干的鼠李糖乳杆菌培养活化，得到活化菌液；

步骤2，将活化菌液分离收集菌体，菌体采用cacl2溶液处理，然后复苏培养，得测试菌液；

步骤3，将测试菌液接种至培养基中，培养至对数期，然后在45-55℃下热胁迫处理，热胁迫完成后，向培养基中加入亚硒酸钠溶液，进行富硒培养。

优选的，步骤1具体为：用经高温高压灭菌后的mrs肉汤培养基溶解冻干的鼠李糖乳杆菌成菌悬液，吸取菌悬液进行培养活化，活化成功后，将各菌株接种到mrs肉汤培养基中，在恒温培养箱中静置37℃下培养，连续活化三代，得到活化菌液。

优选的，步骤2具体为：将活化菌液冰浴，离心，收集菌体，将菌体悬浮于cacl2溶液中，冰浴，离心，收集cacl2处理菌体，再将cacl2处理菌体悬浮于cacl2溶液中，冰浴，热激，再冰浴，然后在mrs液体培养基37℃摇床复苏培养，得测试菌液。

优选的，步骤3中，热胁迫处理温度为45-49℃。

优选的，步骤3中，热胁迫处理时间为5-30min。

进一步的，热胁迫处理时间为5-15min。

优选的，步骤3中，富硒培养时间为28-48h。

进一步的，富硒培养时间为32-40h。

优选的，步骤3中，向培养基中加入亚硒酸钠溶液后，亚硒酸钠的浓度为0.6-2.7μg/ml。

进一步的，向培养基中加入亚硒酸钠溶液后，亚硒酸钠的浓度为0.6-1.6μg/ml。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明以鼠李糖乳杆菌(atcc53103)为研究对象，用cacl2预处理，然后对该菌进行热胁迫，热胁迫之后进行富硒培养，明显提高了鼠李糖乳杆菌富硒效果。推测鼠李糖乳杆菌在热胁迫之后，菌株中一些可以与硒进行结合的蛋白质增加，从而提高了其富硒量效果。

进一步的，本发明评价不同温度胁迫促进鼠李糖乳杆菌富硒的效果，并对胁迫时间、富硒培养时间、硒的浓度进行了研究，优化了条件参数，以提高乳酸菌对硒的富集作用，为富硒乳酸菌在食品工业中的应用提供理论依据。该方法简单易行、效果显著。

附图说明

图1为培养温度对富硒量影响；

图2为培养温度对富硒率影响；

图3为培养时间对鼠李糖乳杆菌富硒量的影响；

图4为培养时间对鼠李糖乳杆菌富硒率的影响；

图5为硒添加量对富硒量影响；

图6为硒添加量对富硒率影响；

图7为热胁迫时间对富硒量的影响；

图8为热胁迫时间对富硒率的影响；

图9为胁迫时间和富硒培养时间对富硒率交互作用的等高线图和曲面图；

图10为胁迫时间和硒添加量对富硒率交互作用的等高线图和曲面图；

图11为富硒培养时间和硒添加量对富硒率交互作用的等高线图和曲面图。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

本发明包括以下步骤：

步骤1，菌种的活化

将0.3-0.5ml经高温高压灭菌后的mrs肉汤培养基注入冻干管中，用移液枪轻轻吹打，使之充分溶解成菌悬液。吸取菌悬液，全部打入2个试管中，在菌种规定条件下培养，活化成功后，为了提高菌种的活力，将各菌株接种到mrs肉汤培养基中，在恒温培养箱中静置37℃下培养24-48h，连续活化三代，得到活化菌液。

步骤2，cacl2预处理活化菌液

将活化菌液加入事先预冷的无菌离心管中，冰上放置30min后，4℃，6000r/min，离心5min收集对数期细胞。弃上清，再将菌体悬浮于10ml的无菌、预冷的0.1mol/l的cacl2溶液中，冰上放置30min，4℃，6000r/min，离心5min；弃上清，再将菌体悬浮于1.5ml的预冷的0.1mol/l的无菌cacl2溶液中，冰浴30min，42℃热激80s，冰浴3min，加5mlmrs液体培养基37℃摇床复苏培养1h，得测试菌液。

步骤3，热迫富硒培养

将上述测试菌液以1％接种量接种于mrs液体培养基中，在45-55℃下热胁迫5-30min，加入10μg/g的亚硒酸钠溶液1-6ml，以未受热胁迫处理的菌液为对照，在37℃，ph值5.6～7.2条件下恒温静置培养28～48h，用生理盐水充分洗涤，离心得菌泥，用电感耦合等离子发射光谱(icp-oes)法测定菌体细胞中有机硒的含量，每组重复测定3次取平均值，按式(1)和式(2)分别计算富硒量和富硒率。

得到的结果如下：

(1)培养温度对富硒效果影响

将测试菌液接种1ml于15ml的mrs液体培养基，于37℃恒温培养6h至对数期后，分别于45℃、47℃、49℃、51℃、53℃、55℃水浴中胁迫10min后，再向上述菌液中加入2ml硒含量10μg/ml的亚硒酸钠溶液。于37℃下恒温静置培养48h后测定其富硒量和富硒率，选出富硒效果最好的胁迫温度。每组做三个平行试验并且设置未受热胁迫的空白组作为对照。所得富硒量及富硒率如图1和图2所示。

结合图1和图2可以看出，随着温度的升高，富硒量和富硒率逐渐升高，在47℃达到最大值，在47℃胁迫后的鼠李糖乳杆菌比空白组富硒量增加了618.66μg/g，富硒率增加了32.17％；之后随着温度的升高，富硒量和富硒率再逐渐下降。

有研究表明在50℃热胁迫30min后鼠李糖乳杆菌中蛋白质增加，包括经典的热休克蛋白groel和dnak等11种蛋白质，并且鼠李糖乳杆菌在热胁迫处理后，一种与abc运输系统相关的蛋白的合成也有所提高。热应激可能会诱导蛋白质的合成，包括伴侣蛋白。可以推测鼠李糖乳杆菌在热胁迫之后，菌株中一些可以与硒进行结合的蛋白质增加，从而提高了其富硒量效果。

(2)热胁迫富硒培养时间对富硒效果的影响

将(1)中所述活化至对数期的鼠李糖乳杆菌，在已经确定的最佳胁迫温度下处理10min，添加2ml硒浓度为10μg/ml的亚硒酸钠溶液后，在37℃下分别恒温培养28h、32h、36h、40h、44h、48h后，测定其富硒量和富硒率。鼠李糖乳杆菌的富硒量和富硒率如图3和图4所示。

结合图3和图4可得，随着富硒培养时间的增长，鼠李糖乳杆菌的富硒效果呈现先升高后降低的趋势，并且在40h处达到最大值，鼠李糖乳杆菌的富硒量为2715.48μg/g，鼠李糖乳杆菌的富硒率为54.31％，但是其上升和下降的趋势并不明显，且在40h后趋于平稳，所以可以得出当富硒培养时间达到40h后，时间的增长对富硒效果的影响较小。

(3)加硒量对富硒效果的影响

将(1)中所述活化至对数期的鼠李糖乳杆菌，在已经确定的最佳胁迫温度下处理10min，分别添加硒浓度为10μg/ml的亚硒酸钠溶液1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml后，在37℃下恒温培养48h后，测定其富硒量和富硒率。鼠李糖乳杆菌的富硒量及富硒率如图5和图6所示。

结合图5和图6可得，随着硒添加量的增高，鼠李糖乳杆菌的富硒效果呈现先升高后降低的趋势，并且在10μg/ml亚硒酸钠添加量为3ml时达到最大值，鼠李糖乳杆菌的富硒量为2820.46μg/g，富硒率为53.83％，再增加硒添加量时富硒量和富硒率开始下降。

因此，可以清楚的看到当亚硒酸盐的浓度达到一定值时，对鼠李糖乳杆菌的富硒能力产生负面影响，推测这个现象的产生是因为高浓度的亚硒酸盐具有较高毒性，会对微生物的生长和代谢产生抑制作用。

(4)热胁迫时间对富硒效果的影响

在最佳胁迫温度47℃下热胁迫不同时间，添加2ml硒浓度为10μg/ml的亚硒酸钠溶液后37℃恒温培养48h，其富硒量和富硒率的变化如图7和图8所示。

结合图7和图8可以看出随着胁迫时间的增加，富硒量和富硒率先逐渐升高，在15min处达到最大值，富硒量为3582.80μg/g，富硒率为57.79％，然后又逐渐下降。

kilstrup等研究分析了各种蛋白质在高温和盐胁迫下合成速率的时间变化以及17种蛋白质在热应激时表现出明显的诱导作用，得出，在热应激后的前10分钟内，有8种蛋白质的合成速率迅速增加，达到了10倍以上的水平。并且发现，热激10～15min后，circe基因的表达会提高10-100倍，而热激20min时，该基因的表达受到了抑制。由此可以推测，鼠李糖乳杆菌胁迫时间在10～15min内，促进了一些基因的表达，使富硒效果增强，而胁迫时间超过20min后，这些基因的表达被抑制，从而影响了富硒效果。

(5)响应面法优化培养条件

根据以上试验的结果，使用响应面法，依据box-behnken中心组合试验设计原理，对热胁迫富硒培养条件进行优化，选择胁迫时间、富硒培养时间、硒添加量三个因素进行考量。响应面试验各因素水平表如表1所示，试验设计方案及结果如表2所示。

表1响应面试验各因素水平表

表2响应面试验设计方案及结果

①回归模型的建立及显著性分析

运用design-expert8.0.6.1软件，对多项式进行回归分析，所得到的二次回归方程为

富硒率＝59.60-2.80×a-1.63×b+12.90×c+2.99×a×b-3.84×a×c

+1.68×b×c-1.54×a²-7.29×b²-3.88×c²

根据上式可以得出，在各个因素对菌株富硒率的影响中，一次项的偏回归方程系数的绝对值从大到小依次为c＞a＞b，说明硒添加量对菌株富硒率的影响最大，其次是胁迫时间，而富硒培养时间对菌株富硒率的影响最小。回归模型的方差分析如表3所示。

表3回归模型的方差分析表

注：prob>f的值小于0.05为影响显著，

prob>f的值小于0.01为影响极显著，

prob>f的值大于0.05为影响不显著。

由表3可知，在用回归方程对各因素与响应值之间的关系进行描述时，因变量和全体自变量之间的线性关系显著(r2＝0.9783)，prob＞f值小于0.01，方程极其显著，由此证明该试验方法是可靠的，可用于热胁迫富硒培养条件优化设计模型。表中的失拟项阐述了实测值与试验预测值不拟合的概率，同时也说明了试验数据与拟合出来的模型的接近程度，其prob＞f(0.1258)大于0.05，不显著，表示回归模型是适合的，试验数据和分析的结果也是可靠的。

②各因素交互作用对富硒率的影响

图9表明胁迫时间和富硒培养时间对富硒率交互作用等高线为马蹄形，且prob＞f的值为0.0422小于0.05，说明胁迫时间和富硒培养时间对富硒率交互作用显著；图10表明胁迫时间和富硒培养时间对富硒率交互作用等高线近似马蹄形，且prob＞f的值为0.0155小于0.05，说明胁迫时间和富硒培养时间对富硒率交互作用显著；图11表明富硒培养时间和硒添加量对富硒率交互作用等高线为椭圆形，且prob＞f的值为0.2058大于0.05，说明富硒培养时间和硒添加量对富硒率交互作用不显著。

通过design-expert8.0.6.1软件进行分析，得到的热胁迫富硒最优培养条件为：胁迫时间为14.88min、富硒培养时间为39.83h、硒添加量为2.92ml。根据实际情况将其圆整为，胁迫时间15min、富硒培养时间40h、硒添加量3ml。为了验证响应面所得结果与实际情况是否一致，根据上述试验结果对菌株进行富硒培养，所得到的富硒率，重复3次计算平均值，得到富硒率为60.03％，与预期的结果59.70％相近，说明优化结果可靠。

由以上结果可知本发明热胁迫的最佳条件：温度是47℃、胁迫时间15min、富硒培养时间40h、亚硒酸钠添加浓度1.6μg/ml。利用电感耦合等离子发射光谱(icp-oes)法测定鼠李糖乳杆菌的富硒量和富硒率，最高分别为3582.80μg/g和60.03％。比空白组分别增加了2461.91μg/g和44.85％。