本发明属于细胞生物学
技术领域：
，具体涉及一种去除细胞培养废液中酚红的方法。
背景技术：
：采用培养基培养完细胞后剩下的培养基可称之为细胞培养废液，多数研究者会将细胞培养废液倒掉，但细胞培养废液中还含有大量的营养物质及生长因子，因此对细胞培养废液进行回收利用具有很好的应用价值。但当回收细胞培养废液时，细胞培养废液中如果存在酚红，一方面会因酚红浓度发生了变化导致ph指示效果发生了变化；另一方面是酚红还会起到雌激素的作用，当采用回收后的细胞培养液培养细胞时，会对细胞产生不利影响。因此，去除细胞培养废液中的酚红是很有必要的。技术实现要素：针对现有技术中的上述不足，本发明提供了一种去除细胞培养废液中酚红的方法，该方法简单，能有效去除细胞废液中的酚红。为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种去除细胞培养废液中酚红的方法，包括以下步骤：(1)将细胞培养废液经3-5kd的超滤膜包进行超滤浓缩至原体积的1/2-2/3；(2)向超滤浓缩后的细胞培养废液中加入2-4倍体积的缓冲液或超纯水进行洗滤；(3)向洗滤后的细胞培养废液中加入tritonx-114，使得tritonx-114的体积浓度为1-5％，于4℃保温30-60min；(4)将步骤(3)所得物置于37-40℃继续保温30-60min，最后离心，去除沉淀。进一步地，步骤(2)中向超滤浓缩后的细胞培养废液中加入3倍体积的缓冲液或超纯水。进一步地，步骤(2)缓冲液为中性缓冲液，优选为pbs缓冲液或0.5mol/l的磷酸缓冲液。进一步地，步骤(3)中所加入的tritonx-114的体积浓度为5％。进一步地，步骤(3)中在4℃保温60min。进一步地，步骤(4)中将步骤(3)所得物置于37℃继续保温60min。本发明提供的去除细胞培养废液中酚红的方法，具有以下技术效果：酚红是小分子物质，首先将细胞培养废液经3-5kd的超滤膜包进行超滤浓缩可以去除一部分酚红，然后用缓冲液对细胞培养废液进行洗滤，缓冲液的量不能过多，过多会使得细胞培养废液中的有效成分流失过多，若缓冲液的量太少，则不能很好的去除酚红残留量，所以缓冲液的量需要在减少酚红残留量和控制有效成分流失之间做平衡，本申请中使用3倍体积的缓冲液进行洗滤，既能保证较高的蛋白回收率，又能较大程度减少酚红残留量；当洗滤后细胞培养废液中还是存在很多酚红溶液，此时采用tritonx-114进行去除，tritonx-114在4℃条件下能与水混溶，在低温4℃条件下tritonx-114和酚红的溶解度都较高，根据物质相似相容原理，酚红会和tritonx-114相容，且均溶于水，而在37℃时，tritonx-114溶解度变小，tritonx-114结合酚红一起析出在下层有机相中，通过离心便可有效去除酚红。此外，tritonx-114对蛋白活性影响很小，因此去除酚红的同时也不会对细胞培养废液中有效物质的活性造成影响。具体实施方式实施例1一种去除细胞培养废液中酚红的方法，包括以下步骤：(1)在干细胞培养传代和换液过程中按无菌操作快速将细胞培养废液转移到无菌容器中，密封保存于4℃冰箱内，保存时间不超过30天；(2)收集废液达到600ml以上，从冰箱内取出装有细胞培养废液的无菌容器，打开瓶盖，倒入料液杯中，料液杯中细胞培养废液的体积为600ml，使用16号蠕动泵软管连接好分子截留量为3kd的超滤膜包(或者超滤管)、料液杯和压力表等装置，然后开启蠕动泵，使压力表显示压力为30bar，待料液杯内细胞培养废液体积减少到原体积一半时(300ml)，关闭蠕动泵。因酚红是小分子物质，通过超滤浓缩可以去除部分酚红。(3)在超滤浓缩后的细胞培养废液中加入900mlpbs缓冲液，同时使用16号蠕动泵软管连接好分子截留量为3kd的超滤膜包(或者超滤管)、料液杯和压力表等装置，然后开启蠕动泵，使压力表显示压力为30bar，待料液杯内细胞培养废液体积减少到原体积一半时(600ml)，关闭蠕动泵。(4)向步骤(3)所得的细胞培养废液中加入tritonx-114，使得tritonx-114的体积浓度为5％，于4℃水浴摇床中振荡处理1h，然后立即放入37℃水浴锅中静置1h。(5)将步骤(4)所得物取出，倒入离心管中，室温条件下，10000r/min离心30min，细胞培养废液分为上层液体状和下层凝胶状，小心吸出分相上清，上清液即为去除酚红以后的细胞培养废液。实施例2一种去除细胞培养废液中酚红的方法，包括以下步骤：(1)在干细胞培养传代和换液过程中按无菌操作快速将细胞培养废液转移到无菌容器中，密封保存于4℃冰箱内，保存时间不超过30天；(2)收集废液达到600ml以上，从冰箱内取出装有细胞培养废液的无菌容器，打开瓶盖，倒入料液杯中，料液杯中细胞培养废液的体积为600ml，使用16号蠕动泵软管连接好分子截留量为3kd的超滤膜包(或者超滤管)、料液杯和压力表等装置，然后开启蠕动泵，使压力表显示压力为30bar，待料液杯内细胞培养废液体积减少到原体积一半时(300ml)，关闭蠕动泵。因酚红是小分子物质，通过超滤浓缩可以去除部分酚红。(3)在超滤浓缩后的细胞培养废液中加入900ml0.5mol/l的磷酸缓冲液，同时使用16号蠕动泵软管连接好分子截留量为3kd的超滤膜包(或者超滤管)、料液杯和压力表等装置，然后开启蠕动泵，使压力表显示压力为30bar，待料液杯内细胞培养废液体积减少到原体积一半时(600ml)，关闭蠕动泵。(4)向步骤(3)所得的细胞培养废液中加入tritonx-114，使得tritonx-114的体积浓度为1％，于4℃水浴摇床中振荡处理1h，然后立即放入40℃水浴锅中静置1h。(5)将步骤(4)所得物取出，倒入离心管中，室温条件下，12000r/min离心15min，细胞培养废液分为上层液体状和下层凝胶状，小心吸出分相上清，上清液即为去除酚红以后的细胞培养废液。实施例3一种去除细胞培养废液中酚红的方法，包括以下步骤：(1)在干细胞培养传代和换液过程中按无菌操作快速将细胞培养废液转移到无菌容器中，密封保存于4℃冰箱内，保存时间不超过30天；(2)收集废液达到600ml以上，从冰箱内取出装有细胞培养废液的无菌容器，打开瓶盖，倒入料液杯中，料液杯中细胞培养废液的体积为600ml，使用16号蠕动泵软管连接好分子截留量为3kd的超滤膜包(或者超滤管)、料液杯和压力表等装置，然后开启蠕动泵，使压力表显示压力为30bar，待料液杯内细胞培养废液体积减少到原体积一半时(300ml)，关闭蠕动泵。因酚红是小分子物质，通过超滤浓缩可以去除部分酚红。(3)在超滤浓缩后的细胞培养废液中加入900ml水，同时使用16号蠕动泵软管连接好分子截留量为3kd的超滤膜包(或者超滤管)、料液杯和压力表等装置，然后开启蠕动泵，使压力表显示压力为30bar，待料液杯内细胞培养废液体积减少到原体积一半时(600ml)，关闭蠕动泵。(4)向步骤(3)所得的细胞培养废液中加入tritonx-114，使得tritonx-114的体积浓度为3％，于4℃水浴摇床中振荡处理30min，然后立即放入40℃水浴锅中静置30min。(5)将步骤(4)所得物取出，倒入离心管中，室温条件下，12000r/min离心15min，细胞培养废液分为上层液体状和下层凝胶状，小心吸出分相上清，上清液即为去除酚红以后的细胞培养废液。实施例4一种去除细胞培养废液中酚红的方法，包括以下步骤：(1)在干细胞培养传代和换液过程中按无菌操作快速将细胞培养废液转移到无菌容器中，密封保存于4℃冰箱内，保存时间不超过30天；(2)收集废液达到600ml以上，从冰箱内取出装有细胞培养废液的无菌容器，打开瓶盖，倒入料液杯中，料液杯中细胞培养废液的体积为600ml，使用16号蠕动泵软管连接好分子截留量为3kd的超滤膜包(或者超滤管)、料液杯和压力表等装置，然后开启蠕动泵，使压力表显示压力为30bar，待料液杯内细胞培养废液体积减少到原体积一半时(300ml)，关闭蠕动泵。因酚红是小分子物质，通过超滤浓缩可以去除部分酚红。(3)在超滤浓缩后的细胞培养废液中加入900mlpbs缓冲液，同时使用16号蠕动泵软管连接好分子截留量为3kd的超滤膜包(或者超滤管)、料液杯和压力表等装置，然后开启蠕动泵，使压力表显示压力为30bar，待料液杯内细胞培养废液体积减少到原体积一半时(600ml)，关闭蠕动泵。(4)向步骤(3)所得的细胞培养废液中加入tritonx-114，使得tritonx-114的体积浓度为2％，于4℃水浴摇床中振荡处理50min，然后立即放入40℃水浴锅中静置40min。(5)将步骤(4)所得物取出，倒入离心管中，室温条件下，10000r/min离心30min，细胞培养废液分为上层液体状和下层凝胶状，小心吸出分相上清，上清液即为去除酚红以后的细胞培养废液。实施例5一种去除细胞培养废液中酚红的方法，包括以下步骤：(1)在干细胞培养传代和换液过程中按无菌操作快速将细胞培养废液转移到无菌容器中，密封保存于4℃冰箱内，保存时间不超过30天；(2)收集废液达到600ml以上，从冰箱内取出装有细胞培养废液的无菌容器，打开瓶盖，倒入料液杯中，料液杯中细胞培养废液的体积为600ml，使用16号蠕动泵软管连接好分子截留量为3kd的超滤膜包(或者超滤管)、料液杯和压力表等装置，然后开启蠕动泵，使压力表显示压力为30bar，待料液杯内细胞培养废液体积减少到原体积一半时(300ml)，关闭蠕动泵。因酚红是小分子物质，通过超滤浓缩可以去除部分酚红。(3)在超滤浓缩后的细胞培养废液中加入900mlpbs缓冲液，同时使用16号蠕动泵软管连接好分子截留量为3kd的超滤膜包(或者超滤管)、料液杯和压力表等装置，然后开启蠕动泵，使压力表显示压力为30bar，待料液杯内细胞培养废液体积减少到原体积一半时(600ml)，关闭蠕动泵。(4)向步骤(3)所得的细胞培养废液中加入tritonx-114，使得tritonx-114的体积浓度为4％，于4℃水浴摇床中振荡处理40min，然后立即放入37℃水浴锅中静置30min。(5)将步骤(4)所得物取出，倒入离心管中，室温条件下，10000r/min离心30min，细胞培养废液分为上层液体状和下层凝胶状，小心吸出分相上清，上清液即为去除酚红以后的细胞培养废液。对比例1一种去除细胞培养废液中酚红的方法，包括以下步骤：(1)在干细胞培养传代和换液过程中按无菌操作快速将细胞培养废液转移到无菌容器中，密封保存于4℃冰箱内，保存时间不超过30天；(2)收集废液达到600ml以上，向细胞培养废液中加入tritonx-114，使得tritonx-114的体积浓度为5％，于4℃水浴摇床中振荡处理1h，然后立即放入37℃水浴锅中静置1h。(3)将步骤(2)所得物取出，倒入离心管中，室温条件下，10000r/min离心30min，细胞培养废液分为上层液体状和下层凝胶状，小心吸出分相上清；(4)取步骤(3)所得上清液600ml，使用16号蠕动泵软管连接好分子截留量为3kd的超滤膜包(或者超滤管)、料液杯和压力表等装置，然后开启蠕动泵，使压力表显示压力为30bar，待料液杯内细胞培养废液体积减少到原体积一半时(300ml)，关闭蠕动泵。(4)在超滤浓缩后的细胞培养废液中加入900mlpbs缓冲液，同时使用16号蠕动泵软管连接好分子截留量为3kd的超滤膜包(或者超滤管)、料液杯和压力表等装置，然后开启蠕动泵，使压力表显示压力为30bar，待料液杯内细胞培养废液体积减少到原体积一半时(600ml)，关闭蠕动泵。对比例2一种去除细胞培养废液中酚红的方法，包括以下步骤：(1)在干细胞培养传代和换液过程中按无菌操作快速将细胞培养废液转移到无菌容器中，密封保存于4℃冰箱内，保存时间不超过30天；(2)收集废液达到600ml以上，从冰箱内取出装有细胞培养废液的无菌容器，打开瓶盖，倒入料液杯中，料液杯中细胞培养废液的体积为600ml，使用16号蠕动泵软管连接好分子截留量为3kd的超滤膜包(或者超滤管)、料液杯和压力表等装置，然后开启蠕动泵，使压力表显示压力为30bar，待料液杯内细胞培养废液体积减少到原体积一半时(300ml)，关闭蠕动泵。因酚红是小分子物质，通过超滤浓缩可以去除部分酚红。(3)向超滤浓缩后的细胞培养废液中加入tritonx-114，使得tritonx-114的体积浓度为5％，于4℃水浴摇床中振荡处理1h，然后立即放入37℃水浴锅中静置1h。(4)将步骤(3)所得物取出，倒入离心管中，室温条件下，10000r/min离心30min，细胞培养废液分为上层液体状和下层凝胶状，小心吸出分相上清，上清液即为去除酚红以后的细胞培养废液。检测实施例1-5和对比例1-2中酚红去除效果：1、颜色观察去除酚红前，细胞培养废液呈红色，去除酚红后，实施例1-5和对比例1-2中细胞培养废液均变为浅黄色。2、酚红含量检测采用双波长分光光度法测定酚红的含量，具体方法为：吸取待测样品0.5ml，加入0.1mol/l的naoh溶液4.5ml，混匀，以0.1mol/l的naoh溶液作为参比，于558nm和570nm处测定吸光度，然后计算酚红浓度，其结果见下表：去除前去除后实施例128.108mg/l1.357mg/l实施例228.108mg/l2.052mg/l实施例328.108mg/l1.953mg/l实施例428.108mg/l2.022mg/l实施例528.108mg/l1.816mg/l对比例128.108mg/l5.618mg/l对比例228.108mg/l9.215mg/l3、蛋白浓度检测采用紫外分光光度法(或者bca检测方法)测定细胞培养废液的蛋白浓度，具体方法为：吸取待测样品3ml，以0.9％nacl溶液作为参比，于260nm和280nm处测定吸光度，然后计算蛋白浓度，其结果见下表：去除前去除后实施例1260.319mg/l226.458mg/l实施例2260.319mg/l214.254mg/l实施例3260.319mg/l213.531mg/l实施例4260.319mg/l219.069mg/l实施例5260.319mg/l218.163mg/l对比例1260.319mg/l208.018mg/l对比例2260.319mg/l242.019mg/l由上述可知，只有通过本发明方法，按照本发明相应步骤来去除酚红，其去除效果优异，去除方法简单，且对细胞培养废液中有效成分不会造成影响。当前第1页12