一种高纯血清白蛋白的制备方法与流程

本发明涉及生物制品和血浆蛋白制品的生产技术领域，具体为一种高纯血清白蛋白的制备方法。

技术背景

血清白蛋白是血浆中的主要成分，也是血浆中含量最多的蛋白质，哺乳动物的白蛋白在基因序列、氨基酸组成以及蛋白质结构上存在较高的相似性，它们的生理功能和生理作用是基本一致的；白蛋白的分子组成差别不大，分子量约66～68千道尔顿。白蛋白的功能主要包括：(1)是维持血液的正常渗透压；(2)运输功能，白蛋白能结合血液中出现的钙离子、脂肪酸、胆红素、色氨酸以及药物等各种物质，并在这些物质的转运中起到了载体的作用；(3)白蛋白是自由基的清除剂，而且血清白蛋白能够抑制多核细胞产生氧自由基；(4)白蛋白还是机体内一种重要的营养物质。白蛋白在血浆中不断地进行代谢更新，血浆白蛋白分解产生的氨基酸，可用于合成组织蛋白，氧化分解以供应能量或转变成其它含氮物质。

纯化的白蛋白具有多种用途，其中主要是在临床上的应用，白蛋白具有提高血浆胶体渗透压、增加血容量以及用于机体白蛋白补充、提高血浆白蛋白的浓度的作用；常用于预防或抢救失血性休克、创伤性休克以及治疗低蛋白血症、肝硬化以及肾疾患所致的腹水和水肿等。

目前，国内外药用白蛋白的纯化方法主要以传统的低温乙醇法为主，该方法对设备要求高，分离步骤多、周期长、工艺条件的控制比较复杂，能源消耗巨大，而且纯化过程中常会导致多聚体的生成等。因此，对于血液来源白蛋白进行分离纯化方法的研究也一直在探索，随着层析技术和层析介质的发展，在血液制品领域也得到了较多的应用。

国外常见的层析分离技术主要采用低温乙醇法+层析法和全层析法等方式进行血液制品纯化(刘力,刘文芳.人血白蛋白分离工艺的历史沿革及发展[J].中国输血杂志.2008.21(4):323-326.)。研究发现，低温乙醇结合层析技术可使白蛋白制备条件温和、生产周期缩短、易于实现工业化生产，但是仍然是基于低温乙醇的改良方法；全层析技术虽然不依赖于低温乙醇的预处理，但是需要多个层析步骤相结合才能达到要求，对设备和技术人员的要求较高，仍未达到工业化普及应用的要求。在实际应用过程中推广的意义仍值得商榷。

技术实现要素：

针对目前国内外血浆蛋白分离技术的现状和存在的不足，本发明的目的在于为血浆蛋白的分离纯化提供一种高效的技术方法。

本发明的技术方案如下：一种高纯血清白蛋白的制备方法，

所述方法采用血清为原料，采用盐析酸沉淀分离法对血清进行粗纯化，获得粗纯化后的血清白蛋白，粗纯化后的血清白蛋白进行层析分离获得高纯血清白蛋白；

所述粗纯化后的步骤具体包括：

第一步、粗纯化血清白蛋白溶液更换为血清白蛋白层析缓冲液：所述缓冲液换液方法，具体为将粗纯化后的血清白蛋白溶液用截留分子量为10kDa的超滤膜进行超滤换液，更换为离子交换层析上样缓冲液或亲和层析上样缓冲液，层析缓冲液换液量为5-20个血清白蛋白溶液体积，换液完成后获得含有血清白蛋白的离子交换层析上样溶液或亲和层析上样溶液；

第二步、对含有血清白蛋白的离子交换层析上样溶液或亲和层析上样溶液进行层析分离，根据紫外吸收峰收集洗脱液(含有纯化的血清白蛋白)，并更换为血清白蛋白保存缓冲液；

第三步、血清白蛋白的病毒灭活，向纯化的血清白蛋白中加入白蛋白稳定剂-辛酸钠，进行巴氏消毒法灭活病毒处理，即为制备的高纯度血清白蛋白；

所述辛酸钠的添加量为0.16～0.18mmol/g蛋白质；将添加了辛酸钠的层析纯化的白蛋白溶液装于密封容器中，放入60±1℃的水浴中，保温灭活处理10h，即为灭活了病毒的高纯血清白蛋白。

进一步地，在第一步中粗纯化血清白蛋白溶液通过超滤的方法更换为血清白蛋白离子交换层析上样缓冲液，并获得离子交换层析上样溶液；

所述第二步具体包括如下步骤：

第二步之一、在层析柱中加入离子层析介质，所述离子层析介质为阴离子层析介质，包括DEAE为配基和Q为配基的层析介质，所述DEAE为N,N-二乙基氨基乙基，diethylaminoethyl，所述Q为N,N-二乙基氨基-2-羟丙基；

第二步之二、加入层析缓冲液平衡层析柱；

第二步之三、将含有血清白蛋白的离子交换层析上样溶液通过层析仪进入层析柱中，控制流速为1mL/min，监测蛋白质紫外吸收峰；

第二步之四、上样完毕后，更换为冲洗缓冲液，进一步去除非特异性结合的杂蛋白，并冲洗至蛋白质紫外吸收峰下降至基线；

第二步之五、冲洗完毕后，更换为洗脱缓冲液，洗脱层析介质结合的血清白蛋白，并收集洗脱的目的蛋白，即为层析纯化的血清白蛋白溶液；

第二步之六、将层析纯化的血清白蛋白洗脱溶液用截留分子量为10kDa的超滤膜进行超滤并更换为血清白蛋白保存缓冲液，换液量为5-20个血清白蛋白溶液体体积，并浓缩至血清白蛋白含量为98-102mg/mL。

进一步地，所述离子交换层析上样缓冲液为20mM的磷酸盐和80mM的NaCl的磷酸盐缓冲液；

所述冲洗缓冲液为20mM的PBS+150mM的NaCl缓冲液，pH值为6-8；

所述洗脱缓冲液为20mM的PBS+1M的NaCl缓冲液，pH值为6-8；

所述血清白蛋白保存缓冲液为150mM的NaCl溶液。

进一步地，在第一步中通过超滤的方法将粗纯化血清白蛋白溶液更换为亲和层析上样缓冲液，并获得亲和层析上样溶液；

所述第二步具体包括如下步骤：

第二步之一、在层析柱中加入亲和层析介质，所述亲合层析介质为对白蛋白具有亲和作用的蓝色染料作为亲和配基，具体为Blue-sepharose FF；

第二步之二、加入5倍柱体积的层析缓冲液平衡层析柱；

第二步之三、将含有血清白蛋白的亲和层析上样溶液通过层析仪进入层析柱中，控制流速为1mL/min，监测蛋白质紫外吸收峰；

第二步之四、上样完毕后，继续用亲和层析上样缓冲液，冲洗至蛋白质紫外吸收峰下降至基线；

第二步之五、冲洗完毕后，更换为洗脱缓冲液，洗脱层析介质结合的血清白蛋白，并收集洗脱的目的蛋白，即为层析纯化的血清白蛋白溶液；

第二步之六、将层析纯化的血清白蛋白洗脱溶液用截留分子量为10kDa的超滤膜进行超滤，并更换为血清白蛋白保存缓冲液，换液量为5-20个血清白蛋白溶液体体积，并浓缩至血清白蛋白含量为98-102mg/mL。

进一步地，所述层析结合缓冲液为50mM的KH2PO4，pH值为6-8；

所述洗脱缓冲液为50mM KH2PO4,1.5M KCl,pH值6-8；

所述血清白蛋白保存缓冲液为150mM的NaCl溶液。

进一步地，纯化制备的高纯度血清白蛋白经过病毒灭活处理；

所述第三步具体包括如下步骤：

6.1、向层析纯化的血清白蛋白中加入白蛋白稳定剂-辛酸钠，所述辛酸钠的添加量参考为0.16～0.18mmol/g蛋白质；

6.2、将添加了辛酸钠的层析纯化的白蛋白溶液装于密封容器中，放入60±1℃的水浴中，保温灭活处理10h，即为灭活了病毒的高纯血清白蛋白。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明的目的是提供一种能提高白蛋白纯度和稳定性的制备方法，为进一步临床应用提供更为可靠的输注安全保障。

本发明以哺乳动物血清为起始原料，开展白蛋白的纯化，血清是在全血的凝集过程中，血液中的大部分凝血因子和纤维蛋白原被活化，进而形成凝集物，经过离心分离后得到的淡黄色液体成分；与血浆相比血液凝集后析出的血清中已经去除了凝血因子、纤维蛋白原等多数的其他蛋白质成分，为血清白蛋白的纯化提供了有益的帮助。

本发明以血清为原料，采用盐析酸沉淀分离法代替低温乙醇分离法，对白蛋白进行粗纯化，然后结合先进的层析技术进行层析分离，达到制备高纯度血浆蛋白的目的。

本发明所述的盐析层析法克服了低温乙醇法工艺步骤复杂、操作条件要求高、操作环境恶劣、设备投入巨大和高耗能等不足，同时也避免了乙醇沉淀过程中多聚体蛋白的产生，能够极大地提高制品的质量。

附图说明

图1为本发明犬血清白蛋白离子交换层析图；

图2为本发明犬血清白蛋白亲和层析图；

图3为本发明马血清白蛋白离子交换层析图；

图4为本发明马血清白蛋白亲和层析图；

图5为本发明猫血清白蛋白离子交换层析图；

图6为本发明猫血清白蛋白亲和层析图；

图7本发明高纯犬血清白蛋白电泳图。

具体实施方式

为了更明晰地阐明本发明具体内容，以下结合具体实施例来进一步描述本发明的优点和特点。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。应当指出，对于本技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

实施例一：离子交换层析制备高纯度犬血清白蛋白

步骤1，将原料犬血清融化后，制备粗纯化的犬血清白蛋白溶液；

步骤2，将步骤1制备出的粗纯犬血清白蛋白溶液用截留分子量为10kDa的超滤膜进行超滤，并更换为离子交换层析上样缓冲液，换液量为10个犬白蛋白溶液体积，换液完成后即为含有犬血清白蛋白的离子交换层析上样溶液；其中离子交换层析上样缓冲液为磷酸盐缓冲液，为含20mM的磷酸盐和80mM的NaCl的磷酸盐缓冲液；缓冲液的pH值为7.0；

在本实施例中，所述粗纯化在生物化学研究应用中使用广泛，是一项重要的操作技术，当蛋白质提取液(有时还杂有核酸、多糖之类)获得后，需要将所要的蛋白与其他杂蛋白分离开来。通常采用粗纯化采用分离用盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法。特点是简便、处理量大，既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白溶液，从而获得粗纯化后的血清白蛋白；

步骤3，将步骤2含有犬血清白蛋白的离子交换层析上样溶液进行离子交换层析分离(见图1)

(1)将10mL阴离子层析介质(DEAE-sepharose Fast Flow)装入XK16/20层析柱中；

(2)用20mM的PBS+80mM的NaCl缓冲液(pH7.0)平衡层析柱；

(3)将含有犬血清白蛋白的层析上样溶液通过AKTA pure层析仪进样至层析柱中，并控制流速为1mL/min，监测蛋白质紫外吸收峰；

(4)上样完毕后，更换为20mM的PBS+150mM的NaCl缓冲液(pH7.0)继续进行冲洗，并控制流速为2mL/min，用以去除未结合的杂质蛋白，并冲洗至蛋白质紫外吸收峰下降至基线，进一步去除非特异性结合的杂蛋白；

(5)冲洗完毕后，更换为20mM的PBS+1M的NaCl洗脱缓冲液(pH7.0)，并控制流速为2mL/min，洗脱层析介质结合的犬血清白蛋白，并收集洗脱的目的蛋白，即为层析纯化的犬血清白蛋白溶液；

(6)将层析纯化的犬血清白蛋白洗脱溶液用截留分子量为10kDa的超滤膜进行超滤，并更换为犬血清白蛋白保存缓冲液，犬血清白蛋白保存缓冲液为150mM的NaCl溶液，换液量为10个犬血清白蛋白溶液体积，并浓缩至犬血清白蛋白含量约为100mg/mL，即为层析制备的犬血清白蛋白溶液；

由于经粗纯化操作处理后，一般体积较大的杂蛋白大部分已被除去。进一步在血清白蛋白细分离的纯化步骤，当被分离的蛋白质溶液流经离子交换层析柱时，带有与离子交换剂相反电荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上，随后用改变pH等办法将吸附的蛋白质洗脱下来，从而获得纯度更高的犬血清白蛋白溶液。

步骤4，往步骤3中层析制备的犬血清白蛋白溶液中加入白蛋白稳定剂-辛酸钠，进行巴氏病毒灭活处理，其中辛酸钠的添加量为：0.16～0.18mmol/g蛋白质；巴氏消毒法灭活病毒处理过程为：将添加了辛酸钠的层析纯化的犬血清白蛋白溶液装于密封容器中，放入60±1℃的水浴中，保温灭活处理10h，即为灭活了病毒的高纯犬血清白蛋白。(见图7)。

在本发明中，还提供一个实施例，本实施例为了有效适配本发明中的特定巴氏消毒灭活处理，并保留层析制备的犬血清白蛋白溶液，采用具有精氨酸、山梨醇、及辛酸钠的混合溶剂，所述精氨酸含量为23-40g/L，所述山梨醇含量为45-70g/L，所述辛酸钠的浓度控制在0.160-0.165mmol/g，并Na⁺浓度控制在146-148mmol/L；

采用上述配比Na⁺对犬血清白蛋白的纯度影响较大，但是本发明应用山梨醇作为保护剂，能够有效保护血液制品中的蛋白质，并实现将多聚体的含量控制下降，并通过控制Na⁺浓度进而实现高效并稳定的灭活效果，在消毒灭活的处理过程中，能够进一步实现稳定了纯度，避免巴氏消毒灭活过程中，产生对犬血清白蛋白浓度的影响；

并所述具体的巴氏消毒灭活处理具体包括如下步骤：

将犬血清白蛋白溶液加入至混合溶剂中，放入40±3℃的水浴中，保温静置2-3h，随后将温度提升至60±1℃，再静置10h，完成灭活处理。

实施例二：亲和层析制备高纯度犬血清白蛋白

步骤1，将原料犬血清融化后，制备粗纯化的犬血清白蛋白溶液；

步骤2，将步骤1制备出的粗纯犬血清白蛋白溶液用截留分子量为10kDa的超滤膜进行超滤，并更换为亲和层析上样缓冲液，换液量为10个犬白蛋白溶液体积，换液完成后即为含有犬血清白蛋白的亲和层析上样溶液；其中亲和层析上样缓冲液为50mM KH2PO4，缓冲液的pH值为7.0；

步骤3，将步骤2含有犬血清白蛋白的亲和层析上样溶液进行亲和层析分离(见图2)

(1)将10mL亲和层析介质(Blue-sepharose FF)装入XK16/20层析柱中；

(2)用5倍柱体积的层析缓冲液平衡层析柱；

(3)将含有犬血清白蛋白的亲和层析上样溶液通过AKTA pure层析仪进样至层析柱中，并控制流速为1mL/min，监测蛋白质紫外吸收峰；

(4)上样完毕后，继续用亲和层析上样缓冲液(50mM KH2PO4，缓冲液的pH值为7.0)进行冲洗，使所有未结合物质都被冲洗出柱子，，并控制流速为2mL/min，并冲洗至蛋白质紫外吸收峰下降至基线，进一步去除非特异性结合的杂蛋白；

(5)冲洗完毕后，更换为洗脱缓冲液：50mM KH2PO4,1.5M KCl,pH 7.0，，并控制流速为2mL/min，洗脱亲和介质结合的犬血清白蛋白，并收集洗脱的目的蛋白，即为亲和层析纯化的犬血清白蛋白溶液；

(6)将层析纯化的犬血清白蛋白洗脱溶液用截留分子量为10kDa的超滤膜进行超滤，并更换为犬血清白蛋白保存缓冲液，犬血清白蛋白保存缓冲液为150mM的NaCl溶液，换液量为10个犬血清白蛋白溶液体积，并浓缩至犬血清白蛋白含量约为100mg/mL，即为层析制备的犬血清白蛋白溶液；

步骤4，往步骤3中层析制备的犬血清白蛋白溶液中加入白蛋白稳定剂-辛酸钠，进行巴氏病毒灭活处理，其中辛酸钠的添加量为：0.16～0.18mmol/g蛋白质；巴氏消毒法灭活病毒处理过程为：将添加了辛酸钠的层析纯化的犬血清白蛋白溶液装于密封容器中，放入60±1℃的水浴中，保温灭活处理10h，即为灭活了病毒的高纯犬血清白蛋白。

实施例三：离子交换层析制备高纯度马血清白蛋白

步骤1，将原料马血清融化后，制备粗纯化的马血清白蛋白溶液；

步骤2，将步骤1制备出的粗纯马血清白蛋白溶液用截留分子量为10kDa的超滤膜进行超滤，并更换为离子交换层析上样缓冲液，换液量为10个马白蛋白溶液体积，换液完成后即为含有马血清白蛋白的离子交换层析上样溶液；其中离子交换层析上样缓冲液为磷酸盐缓冲液，为含20mM的磷酸盐和80mM的NaCl的磷酸盐缓冲液；缓冲液的pH值为7.0；

步骤3，将步骤2含有马血清白蛋白的离子交换层析上样溶液进行离子交换层析分离(见图3)

(1)将10mL阴离子层析介质(DEAE-sepharose Fast Flow)装入XK16/20层析柱中；

(2)用20mM的PBS+100mM的NaCl缓冲液(pH7.0)平衡层析柱；

(3)将含有马血清白蛋白的层析上样溶液通过AKTA pure层析仪进样至层析柱中，并控制流速为1mL/min，监测蛋白质紫外吸收峰；

(4)上样完毕后，更换为20mM的PBS+150mM的NaCl缓冲液(pH7.0)继续进行冲洗，并控制流速为2mL/min，去除未结合杂质蛋白，并冲洗至蛋白质紫外吸收峰下降至基线，进一步去除非特异性结合的杂蛋白；

(5)冲洗完毕后，更换为20mM的PBS+1M的NaCl缓冲液(pH7.0)，并控制流速为2mL/min，洗脱层析介质结合的马血清白蛋白，并收集洗脱的目的蛋白，即为层析纯化的马血清白蛋白溶液；

(6)将层析纯化的马血清白蛋白洗脱溶液用截留分子量为10kDa的超滤膜进行超滤，并更换为马血清白蛋白保存缓冲液，马血清白蛋白保存缓冲液为150mM的NaCl溶液，换液量为10个马血清白蛋白溶液体积，并浓缩至马血清白蛋白含量约为100mg/mL，即为层析制备的马血清白蛋白溶液；

步骤4，往步骤3中层析制备的马血清白蛋白溶液中加入白蛋白稳定剂-辛酸钠，进行巴氏病毒灭活处理，其中辛酸钠的添加量为：0.16～0.18mmol/g蛋白质；巴氏消毒法灭活病毒处理过程为：将添加了辛酸钠的层析纯化的马血清白蛋白溶液装于密封容器中，放入60±1℃的水浴中，保温灭活处理10h，即为灭活了病毒的高纯马血清白蛋白。

实施例四：亲和层析制备高纯度马血清白蛋白

步骤1，将原料马血清融化后，制备粗纯化的马血清白蛋白溶液；

步骤2，将步骤1制备出的粗纯马血清白蛋白溶液用截留分子量为10kDa的超滤膜进行超滤，并更换为亲和层析上样缓冲液，换液量为10个马白蛋白溶液体积，换液完成后即为含有马血清白蛋白的亲和层析上样溶液；其中亲和层析上样缓冲液为50mM KH2PO4，缓冲液的pH值为7.0；

步骤3，将步骤2含有马血清白蛋白的亲和层析上样溶液进行亲和层析分离(见图4)

(1)将10mL亲和层析介质(Blue-sepharose FF)装入XK16/20层析柱中；

(2)用5倍柱体积的层析缓冲液平衡层析柱；

(3)将含有马血清白蛋白的亲和层析上样溶液通过AKTA pure层析仪进样至层析柱中，并控制流速为1mL/min，监测蛋白质紫外吸收峰；

(4)上样完毕后，继续用亲和层析上样缓冲液(50mM KH2PO4，缓冲液的pH值为7.0)进行冲洗，并控制流速为2mL/min，使所有未结合物质都被冲洗出柱子，并冲洗至蛋白质紫外吸收峰下降至基线，进一步去除非特异性结合的杂蛋白；

(5)冲洗完毕后，更换为洗脱缓冲液：50mM KH2PO4,1.5M KCl,pH 7.0，洗脱亲和介质结合的马血清白蛋白，并控制流速为2mL/min，并收集洗脱的目的蛋白，即为亲和层析纯化的马血清白蛋白溶液；

(6)将层析纯化的马血清白蛋白洗脱溶液用截留分子量为10kDa的超滤膜进行超滤，并更换为马血清白蛋白保存缓冲液，马血清白蛋白保存缓冲液为150mM的NaCl溶液，换液量为10个马血清白蛋白溶液体积，并浓缩至马血清白蛋白含量约为100mg/mL，即为层析制备的马血清白蛋白溶液；

步骤4，往步骤3中层析制备的马血清白蛋白溶液中加入白蛋白稳定剂-辛酸钠，进行巴氏病毒灭活处理，其中辛酸钠的添加量为：0.16～0.18mmol/g蛋白质；巴氏消毒法灭活病毒处理过程为：将添加了辛酸钠的层析纯化的马血清白蛋白溶液装于密封容器中，放入60±1℃的水浴中，保温灭活处理10h，即为灭活了病毒的高纯马血清白蛋白。

实施例五：离子交换层析制备高纯度猫血清白蛋白

步骤1，将原料猫血清融化后，制备粗纯化的猫血清白蛋白溶液；

步骤2，将步骤1制备出的粗纯猫血清白蛋白溶液用截留分子量为10kDa的超滤膜进行超滤，并更换为离子交换层析上样缓冲液，换液量为10个猫白蛋白溶液体积，换液完成后即为含有猫血清白蛋白的离子交换层析上样溶液；其中离子交换层析上样缓冲液为磷酸盐缓冲液，为含20mM的磷酸盐和80mM的NaCl的磷酸盐缓冲液；缓冲液的pH值为7.0；

步骤3，将步骤2含有猫血清白蛋白的离子交换层析上样溶液进行离子交换层析分离(见图5)

(1)将10mL阴离子层析介质(DEAE-sepharose Fast Flow)装入XK16/20层析柱中；

(2)用20mM的PBS+90mM的NaCl缓冲液(pH7.0)平衡层析柱；

(3)将含有猫血清白蛋白的层析上样溶液通过AKTA pure层析仪进样至层析柱中，并控制流速为1mL/min，监测蛋白质紫外吸收峰；

(4)上样完毕后，更换为20mM的PBS+150mM的NaCl缓冲液(pH7.0)继续进行冲洗，并控制流速为2mL/min，冲洗至蛋白质紫外吸收峰下降至基线，用以去除杂质蛋白；

(5)冲洗完毕后，更换为20mM的PBS+1M的NaCl缓冲液(pH7.0)，并控制流速为2mL/min，洗脱层析介质结合的猫血清白蛋白，并收集洗脱的目的蛋白，即为层析纯化的猫血清白蛋白溶液；

(6)将层析纯化的猫血清白蛋白洗脱溶液用截留分子量为10kDa的超滤膜进行超滤，并更换为猫血清白蛋白保存缓冲液，猫血清白蛋白保存缓冲液为150mM的NaCl溶液，换液量为10个猫血清白蛋白溶液体积，并浓缩至猫血清白蛋白含量约为100mg/mL，即为层析制备的猫血清白蛋白溶液；

步骤4，往步骤3中层析制备的猫血清白蛋白溶液中加入白蛋白稳定剂-辛酸钠，进行巴氏病毒灭活处理，其中辛酸钠的添加量为：0.16～0.18mmol/g蛋白质；巴氏消毒法灭活病毒处理过程为：将添加了辛酸钠的层析纯化的猫血清白蛋白溶液装于密封容器中，放入60±1℃的水浴中，保温灭活处理10h，即为灭活了病毒的高纯猫血清白蛋白。

实施例六：亲和层析制备高纯度猫血清白蛋白

步骤1，将原料猫血清融化后，制备粗纯化的猫血清白蛋白溶液；

步骤2，将步骤1制备出的粗纯猫血清白蛋白溶液用截留分子量为10kDa的超滤膜进行超滤，并更换为亲和层析上样缓冲液，换液量为10个猫白蛋白溶液体积，换液完成后即为含有猫血清白蛋白的亲和层析上样溶液；其中亲和层析上样缓冲液为50mM KH2PO4，缓冲液的pH值为7.0；

步骤3，将步骤2含有猫血清白蛋白的亲和层析上样溶液进行亲和层析分离(见图2)

(1)将10mL亲和层析介质(Blue-sepharose FF)装入XK16/20层析柱中；

(2)用5倍柱体积的层析缓冲液平衡层析柱；

(3)将含有猫血清白蛋白的亲和层析上样溶液通过AKTA pure层析仪进样至层析柱中，并控制流速为1mL/min，监测蛋白质紫外吸收峰；

(4)上样完毕后，继续用亲和层析上样缓冲液(50mM KH2PO4，缓冲液的pH值为7.0)进行冲洗，并控制流速为1.5mL/min，使所有未结合物质都被冲洗出柱子，并冲洗至蛋白质紫外吸收峰下降至基线，进一步去除非特异性结合的杂蛋白；

(5)冲洗完毕后，更换为洗脱缓冲液：50mM KH2PO4,1.5M KCl,pH 7.0，并控制流速为1.5mL/min，洗脱亲和介质结合的猫血清白蛋白，并收集洗脱的目的蛋白，即为亲和层析纯化的猫血清白蛋白溶液；

(6)将层析纯化的猫血清白蛋白洗脱溶液用截留分子量为10kDa的超滤膜进行超滤，并更换为猫血清白蛋白保存缓冲液，猫血清白蛋白保存缓冲液为150mM的NaCl溶液，换液量为10个猫血清白蛋白溶液体积，并浓缩至猫血清白蛋白含量约为100mg/mL，即为层析制备的猫血清白蛋白溶液；

步骤4，往步骤3中层析制备的猫血清白蛋白溶液中加入白蛋白稳定剂-辛酸钠，进行巴氏病毒灭活处理，其中辛酸钠的添加量为：0.16～0.18mmol/g蛋白质；巴氏消毒法灭活病毒处理过程为：将添加了辛酸钠的层析纯化的猫血清白蛋白溶液装于密封容器中，放入60±1℃的水浴中，保温灭活处理10h，即为灭活了病毒的高纯猫血清白蛋白。

实施例七：本发明实施例中提供了血清白蛋白溶液的病毒灭活方法的验证，实施例与上述实施例中所制备的血清白蛋白；

将层析获得的高纯犬血清白蛋白、马血清白蛋白和猫血清白蛋白分别取9mL，置于试管中备用；以伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)作有囊膜DNA病毒的指示病毒，为有囊膜的DNA病毒的代表；将上述3中血清白蛋白，按照样品:指示病毒为9:1的比例分别加入1mL伪狂犬病毒液，混匀后取样1mL，作为染毒后的样品备检；将染毒后的剩余样品放置于电热恒温水浴锅中，控制水浴温度为60±1℃，保温处理10小时；分别于1h、2h、4h、8h、10h各取样1mL，立即放置于-70℃保存备检。

将层析获得的高纯犬血清白蛋白、马血清白蛋白和猫血清白蛋白分别取9mL，置于试管中备用；以水疱性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus,VSV)作有囊膜RNA病毒的指示病毒，为有囊膜的RNA病毒的代表；将上述3中血清白蛋白，按照样品:指示病毒为9:1的比例分别加入1mL伪狂犬病毒液，混匀后取样1mL，作为染毒后的样品备检；将染毒后的剩余样品放置于电热恒温水浴锅中，控制水浴温度为60±1℃，保温处理10小时；分别于1h、2h、4h、8h、10h各取样1mL，立即放置于-70℃保存备检。

将层析获得的高纯犬血清白蛋白、马血清白蛋白和猫血清白蛋白分别取9mL，置于试管中备用；以脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus，EMCV)作无囊膜RNA病毒的指示病毒，为无囊膜的RNA病毒的代表；将上述3中血清白蛋白，按照样品:指示病毒为9:1的比例分别加入1mL伪狂犬病毒液，混匀后取样1mL，作为染毒后的样品备检；将染毒后的剩余样品放置于电热恒温水浴锅中，控制水浴温度为60±1℃，保温处理10小时；分别于1h、2h、4h、8h、10h各取样1mL，立即放置于-70℃保存备检。

将层析获得的高纯犬血清白蛋白、马血清白蛋白和猫血清白蛋白分别取9mL，置于试管中备用；猪细小病毒(Porcine parvovirus，PPV)作无囊膜DNA病毒的指示病毒，为无囊膜的DNA病毒的代表；将上述3中血清白蛋白，按照样品:指示病毒为9:1的比例分别加入1mL伪狂犬病毒液，混匀后取样1mL，作为染毒后的样品备检；将染毒后的剩余样品放置于电热恒温水浴锅中，控制水浴温度为60±1℃，保温处理10小时；分别于1h、2h、4h、8h、10h各取样1mL，立即放置于-70℃保存备检。

样品中残余病毒的检测，按照50％终点法测定检测样品中指示病毒的滴度。所有样品取样于室温融化后，立即用细胞培养液进行适当稀释，接种96孔板，每天观察细胞病变，记数细胞病变孔数，并记录细胞病变情况。

指示病毒滴度降低值大于logTCID50/0.1mL，即认为该病毒灭活方法灭活各种病毒均有效。

病毒滴度降低值＝零点对照样品病毒滴度-巴氏消毒处理后样品的病毒滴度。

实施例八：本实施例中提供了病毒灭活血清白蛋白的检测；

按巴氏消毒的方法对3种血清白蛋白进行病毒灭活处理，对伪狂犬病毒的灭活效果结果见表1。

表1样品中残余伪狂犬病毒滴度

从表1可以看出，三种样品经巴氏消毒工艺灭活后，均未检测到伪狂犬病毒，表明巴氏消毒处理法可以有效灭活血清白蛋白中残余的伪狂犬病毒及伪狂犬病毒相似的病毒。

按巴氏消毒的方法对3种血清白蛋白进行病毒灭活处理，对水疱性口炎病毒的灭活效果结果见表2。

表2样品中残余水疱性口炎病毒滴度

从表2可以看出，三种样品经巴氏消毒工艺灭活后，均未检测到水疱性口炎病毒，表明巴氏消毒处理法可以有效灭活血清白蛋白中残余的水疱性口炎病毒及水疱性口炎病毒相似的病毒。

按巴氏消毒的方法对3种血清白蛋白进行病毒灭活处理，对脑心肌炎病毒的灭活效果结果见表3。

表3样品中残余脑心肌炎病毒滴度

从表3可以看出，三种样品经巴氏消毒工艺灭活后，均未检测到脑心肌炎病毒，表明巴氏消毒处理法可以有效灭活血清白蛋白中残余的脑心肌炎病毒及脑心肌炎病毒相似的病毒。

按巴氏消毒的方法对3种血清白蛋白进行病毒灭活处理，对猪细小病毒的灭活效果结果见表4。

表4样品中残余猪细小病毒滴度

从表4可以看出，三种样品经巴氏消毒工艺灭活后，均未检测到猪细小病毒，表明巴氏消毒处理法可以有效灭活血清白蛋白中残余的猪细小病毒及猪细小病毒相似的病毒。

通过对血清白蛋白中加入的4种代表性病毒的巴氏消毒法灭活病毒的检测结果可以看出，血清白蛋白溶液经巴氏消毒法处理能够完全灭活白蛋白中可能残余的病毒，经过该方法处理后更加能够确保血清白蛋白的安全性。