一种适用于高通量基因分型的水稻DNA样本的提取方法与流程

本发明涉及水稻dna样本提取的技术领域，特别是涉及一种适用于高通量基因分型的水稻dna样本的提取方法。

背景技术：

对于植物基因分型来说，一般都需要从数量庞大的群体中进行筛选，同时，以不杀死植物的方式从各个植物获得组织样品。此外，每个样品与编号一一对应，以便准确筛选出目标植株后能种植繁种。目前，没有可用于对单个植物进行高通量组织取样的方法，普遍采用的方法是技术人员取植物的叶片或其他组织器官并编号，使被取植物样品与编号一一对应，但其费时费力、成本高、效率低等缺点显而易见。现在，科学工作者进行基因分型，常用方法是从成千上百甚至更多群体中提取dna来进行单株筛选，而对某基因的定位也经常需要从成千上百份分离群体中提取dna筛选目标位点，其工作量之大显而易见。另外，基因分型普遍使用较多的dna提取方法为sds法、ctab法、碱裂解法及其改良后的方法等。尽管利用传统的sds、ctab和sds-ctab等方法从植物中提取的dna质量、产量和纯度均较高，符合普通pcr检测的要求。但这些方法通常操作步骤繁多复杂，过程费力，耗时长，成本高，成为限制水稻大规模突变体建库过程中提高效率和降低成本的关键因素。

因此，建立一种适用于pcr扩增分析的简易、高效和低成本的dna提取方法是十分迫切和必要的。

技术实现要素：

本发明的目的是提供了一种适用于高通量基因分型的水稻dna样本的提取方法。

本发明的技术方案包括以下步骤：

提取双层生长板，所述生长板包括置于上方的96深孔板以及置于下方的96孔pcr板，所述96深孔板和所述96孔pcr板采用橡皮筋固定，所述96深孔板的每个孔底部有3mm的孔洞，所述96孔pcr板的管体中填充有蒸馏水；

将水稻种子播种于双层生长板中96深孔板的孔中，每个孔中放置一粒种子；

将播种后的双层生长板置于托盘中，所述托盘装有蒸馏水，保证水面淹没生长板下层的96孔pcr板；

将托盘置于30℃，12h光照的培养箱中培养9d，使得96深孔板中种子的根部能穿过底部孔洞延伸至96孔pcr板对应的孔中；

采用冷冻液将培养后的双层生长板进行冷冻处理；

冷冻处理后，取出双层生长板，并将双层生长板中的96深孔板和96孔pcr板分开，将含幼苗的96深孔板放置于蒸馏水中继续培养，下层含根部组织的96孔pcr板用于提取dna。

优选的，所述水稻种子使用前需进行预处理，即将水稻种子依次在70％乙醇中浸泡1min，2.5％次氯酸钠溶液中浸泡30min，然后消毒处理后，浸泡在水中1d，再用湿抹布包裹住种子催芽1d。

优选的，将培养后的双层生长板96深孔板和96孔pcr板之间插入若干玻璃棒，使两层板之间产生空隙，然后再进行冷冻处理。

优选的，在冷冻处理之前，需要将双层生长板的96孔pcr板与多孔金属热块进行插接，即将pcr板的管体插入到金属热块的孔中，再将多孔金属热块置于冷冻液中进行冷冻处理,,所述冷冻液的高度低于多孔金属热块的高度。

优选的，所述冷冻液是由3kg干冰和500ml95％乙醇提取而成。

优选的，所述冷冻处理的时间为6min。

优选的，所述dna提取方法为在含有根部组织的pcr板每个孔中加入20ulph为8.5的tris-edta溶液(所述ph为8.5的tris-edta溶液是由ph为8的500mmtris水溶液和ph为9的50mmedta水溶液按体积比为1:1混合后制得)和200ul蒸馏水，将pcr板孔密封，放在高通量组织研磨机中6min1500rmp磨碎，再3600rmp离心10min，取上清液即为获取的dna。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明通过将96深孔板和96孔pcr板相结合制成双层生长板，利用该双层生长板对水稻种子进行培育，可以一次性提取96组水稻根部dna样本，克服了传统方法的工作量巨大、费时费力、不能高通量提取dna等缺点；该方法高度可行，适用于自动化；本发明的dna提取方法也可适用于其他生物样本。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明所提取的双层生长板的实物图；

图2为本发明实施例采用不同方法提取的dna电泳检测图。

具体实施方式

下面结合具体实施例1和附图对本发明作进一步的说明。

材料与试剂

1.1实验材料

水稻种子、96孔深孔板、96孔pcr板、金属球(d＝0.3cm)、弹性皮、金属托盘(32cm×22cm×3cm)、微孔板金属热块(qblock-0.2)、高通量组织研磨机(2010genogrinder)、玻璃棒(d＝0.35cm)、自动微量分液系统(mantis)等。

1.2实验试剂

干冰、乙醇(95％v/v)、2％ctab提取液、500mmtris(ph8)、50mmedta(ph＝9)、2.5％次氯酸钠溶液等。

2.2种子的处理与幼苗的培养

2.2.1种子的处理

将水稻种子在70％乙醇中浸泡1min，2.5％次氯酸钠溶液中浸泡30min，消毒处理后，浸泡在水中1d，再用湿抹布包裹住种子催芽1d。

注意：非常重要的是种子不含任何小颗粒的土壤或其他可能落入种子孔中的碎片。

2.2.2幼苗的培养

将深孔板清洁干净待用，再使用水管将下部根板的每个孔填充满蒸馏水。将催芽效果最佳的水稻种子放入上部种子板中，胚向下，然后，将上部种子板与下部根板拼接起来。将上部种子板放在下部根板的顶部，并用橡皮筋将两板固定在一起，放入金属托盘中，加入蒸馏水至水漫过水稻长度的三分之一(约3cm)，放置于培养箱中培养约9d(培养条件：30℃恒温)。

注意：在水稻种子生长过程中及时更换补充水分；确保对齐上部种子板和下部根板，使上部苗板底部的孔牢牢的固定在下部根板的凸起边缘，同时注意两板处于相同的方向(即上部种子板板孔应放置于对应的下部根板板孔中)。

2.3水稻幼苗根部组织捕获和dna提取

2.3.1水稻幼苗根部组织捕获

随着幼苗生长供水耗尽，水位下降，要通过人工补水使下部根板不断充满水。水稻种子培养约9d后，下部根板的孔中存在大量的根，即根到达下部根板的底部根时捕获水稻幼苗根组织。在根部组织收获之前，必须使下部根板中的水下降到低于上部种子板的尖端的水平。在冷冻之前，在上部种子板与下部根板之间插入玻璃棒，目的是冷冻下部根板用于根部组织收获，玻璃棒能更容易分离上部种子板和下部根板。

水稻根部组织捕获的具体方法：

从金属托盘中取出堆叠的上下部板，此时，水稻幼苗已长出深孔板，将橡皮筋留在原位，用双手在两板之间打开一个间隙，小心地在上下板之间插入玻璃棒，在两个板之间形成一个间隙，从孔中可以清晰的观察到内部的根与苗。

将多孔金属热块拼在一起放入金属托盘中，干冰和95％(v/v)乙醇混合物放在金属热块周围。小心地将95％(v/v)乙醇倒入玻璃盘中，直到干冰和乙醇的水平恰好低于金属热块的表面。让金属热块冷却约30min以使温度达到平衡。

将pcr板的管体放入金属热块中的孔中，上部种子板仍由橡皮筋固定，并且在板之间仍然存在玻璃棒。将堆叠的板放在金属热块上约6min，在此期间pcr板的管体中的水将冻结固体。6min后从金属热块上移出，移除橡皮筋，并从板之间移除玻璃棒。向下按压上部种子板，即可小心地分开上部种子板与下部pcr管体，捕获根部，清除下部根板的表面的残冰与断根。收获组织后，应将上部幼苗平板转移到装满水的金属托盘中，以使幼苗继续生长。

注意：分离两个板的最佳方法是将上部种子板从下部pcr管体上剥离。在此过程中，在下部pcr管体中冷冻的根在冰水平处断裂，在下部pcr管体中留下冷冻根组织的样品，而在上部种子中留下可存活的幼苗。在下部根板冷冻期间将玻璃棒留在适当位置有助于在下部根板中的水冷冻之后分离上部种子板和下部pcr管体。

2.3.2dna批量提取

将金属球洒在球载装置的表面上并轻轻摇动，以允许单个金属球停留在球载装置的每个孔中。将下部根板的孔与球载装置上孔一一对应，牢牢地固定在一起。用力推球装载装置下的圆柱形塑料板，使金属球落入下部根板的孔中。然后，将20ultris-edta(500mmtris，ph8和50mmedta，ph＝9等体积混合)溶液和根部组织放入含有200ul蒸馏水的pcr板孔中密封，放在高通量组织研磨机(2010genogrinder)中6min1500rmp磨碎，再放入一种装有96微孔板载体的离心机3600rmp离心10min，取上清液用微孔板分光光度计测量相关指标，并移至另一个pcr板中于-20℃保存备用，也可用自动微量分液系统构建所需体系并进行批量pcr扩增。

2.4dna提取结果分析

表1不同提取方法dna浓度、质量及时间

注：ctab法、磁珠法(根研磨)、磁珠法(根不研磨)的dna溶解于60ulte或蒸馏水中。

从表1可知，本研究采用四种方法对水稻幼苗的根部进行dna提取，并比对提取dna的浓度、质量及时间。从浓度与质量上来看，相比较其他三种方法，使用tris-edta法提取的dna个体差异较小，整体浓度较高，平均值为92.54ng/ul；tris-edta法提取的dnaa260/280平均值为1.74，a260/230的平均值为0.5，与两种磁珠法的dna没有明显区别，低于ctab法。从效率上来看，tris-edta法批量提取dna的时间为30min明显低于其他三种方法，效率最高。另外，tris-edta法提取dna的费用非常低。可见，tris-edta法提取dna的产量高，效率高，费用低，绝大多数样品中的蛋白质、酚类等杂质含量较少，并且具有很高的稳定性。

采用不同方法提取的dna电泳检测图(图2)，其中图2-a为四种提取dna方法的检测；m：dl2000dnaladdermarker；1为ctab法；2为tris-edta法；3为磁珠法(根研磨)；4为磁珠法(根不研磨)。图2-b为tris-edta法批量dna检测。从图2中可以看出，tris-edta法提取的dna条带与其他三种方法明亮接近，条带清晰、单一无弥散，不发生降解。根据电泳结果表明，tris-edta法方法提取的基因组dna从浓度、效率两方面都明显优于其他三种方法。由tris-edta法批量提取提取的dna样品批量电泳检测图可知，批量提取的水稻基因组dna片段条带清晰，不发生降解，分子量大，而且没有rna污染，浓度高，并且批量样品的质量稳定。和传统的dna提取法相比，本研究tris-edta法批量提取96个样本dna的时间约为0.3h，并且dna质量完全满足分子标记需求。此外，tris-edta法提取dna的费用约为0.1元/样品，而ctab法为0.8元/样品。可见，本研究开发的tris-edta法提取dna的产量高、效率高、费用低，是比较理想的水稻根部dna提取技术，非常适合水稻的高通量基因分型。

因此，以往筛选突变体遗传分离基因的方法主要集中在田间试验，但该方法弊大于利，时间及工作量耗费巨大，对高通量大规模筛选存在一定的限制。而高通量筛选技术的诞生大大的提高了筛选效率，可以减少劳力以及原料成本，大大缩减了研发成本，规模缩小至深孔板水平是实现高通量筛选的途径之一。基于以上考虑，本文所研究的方法能够把水稻种植于深孔板中，一次捕获96株水稻的根部组织，极大地减少了取样的时间，简化了流程，省时省力，成本低。而且，用tris-edta法能方便高效地获取植株样本dna，其效率与产量明显高于传统的dna提取方法，并且dna扩增条带清晰，检测水稻幼苗目的基因植株，有效地减少了传统方法繁重的工作量，为育种工作提供了高效精准的检测手段。总之，我们在本研究中描述的方法允许植物育种者比现有技术更低成本的更高效的提取dna，为水稻分子辅助育种提供有效的技术支持。

本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处。综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。