本发明涉及烟草种植领域，具体涉及一种抑制烟草疫霉菌的试验方法。
背景技术：
由致病疫霉菌引起的烟草黑胫病是我国烟草的主要根茎类病害，最早发生于黄淮烟区，目前各主要产烟区均有不同程度的发生，其中安徽、山东、河南为历史上的重病区。由于连作烟田面积不断扩大，连作年限不断增加，加重了该病害的流行。据不完全统计，我国平均每年因烟草黑胫病造成的经济损失达1亿元以上。目前生产上对于烟草黑胫病的防治，主要采用甲霜灵锰锌类的复配制剂进行防治，由于长期、过量或不规范用药，导致甲霜灵、代森锰锌的降解物成为目前我国烟叶中的主要农药残留成分之一，与些同时，病原菌对此类药物的抗药性也不断增强，药效有所降低，农田微生态失衡和环境污染严重等问题日益突出。
近年来随着绿色发展理念的提出，烟草和大农业作物的病虫害绿色防控越来越受到重视。采用高效生防菌剂对烟草黑胫病进行生物防治，对减少烟叶农药残留、降低环境污染、维护农田生态平衡具有重要意义。制备生防菌剂的前提是获得具有抑制病原菌的生防菌株，且单一菌株（种）来源的生防菌剂在大田应用中会存在效果不稳定的情况，因此需要对不同菌株（种）进行复配，以增强其使用效果的稳定性。
技术实现要素：
本发明提供一种对不同菌株（种）进行复配，以增强其使用效果稳定性的抑制烟草疫霉菌的试验方法。
本发明的技术方案是这样实现的：一种抑制烟草疫霉菌的试验方法，其方法如下：采用平板稀释涂布法分离烟草黑胫病发病烟田健康烟株根际土壤微生物，通过平板对峙试验筛选出烟草疫霉菌的拮抗细菌2株以及木霉菌3株；2株拮抗细菌编号分别为b1和b2，其单菌抑菌率均达80%以上，其中b1对烟草疫霉菌的抑制率达90%以上，经鉴定两者均为多粘类芽孢杆菌；3株木霉菌编号分别为ycs-tr1、ycs-tr2和ycs-tr3，其单抑菌率均达94%以上，经鉴定分别为绿木霉菌、近渐绿木霉菌和拟康宁木霉菌；
按照下述发酵条件对上述拮抗细菌以及木霉菌进行发酵处理，并得到物种发酵液：2株拮抗细菌的发酵培养基均为葡萄糖10g，豆粕10g以及mgso40.2g/l，发酵起始ph值为6～7，培养温度27℃，摇床转速180r/min，接种量1%，装液量200ml/500ml，培养时间为48h，活菌量均达108cfu/ml以上；3株木霉菌的发酵培养基均为为玉米粉25g、葡萄糖15g、玉米蛋白粉15g、nacl1.3g、mgso40.4g/l、k2hpo40.8g以及caco32g/l，培养温度27℃，发酵起始ph值为6，转速180r/min，接种量为6%，装瓶量150ml/500ml，发酵时间为9d，厚垣孢子数均达107个/ml；
将经过上述进行发酵处理后的3株木霉菌发酵液和2株拮抗细菌发酵液分别进行任意两种不同菌株之间1﹕1和任意三种不同菌株之间1﹕1﹕1组合，并将组合后的十五种组合物分别稀释100倍和300倍，取各稀释液200μl在pda平板上涂布，测量各处理疫霉菌菌丝生长量，并根据菌丝生长量计算生防菌室内抑菌效果，最终得到抑制烟草疫霉菌的最优抑菌效果。
所述的十五种组合物依次为：tr1+b1、tr1+b2、tr2+b1、tr2+b2、tr3+b1、tr3+b2、b1+b2+tr1、b1+b2+tr2、b1+b2+tr3、tr1+tr2+b1、tr1+tr2+b2、tr1+tr3+b1、tr1+tr3+b2、tr2+tr3+b1以及tr2+tr3+b2。
所述的tr1+b1稀释100倍的抑菌率为96.82%，tr1+b1稀释300倍的抑菌率为96.56%，tr1+b2稀释100倍的抑菌率为97.31%，tr1+b2稀释300倍的抑菌率为96.64%，tr2+b1稀释100倍的抑菌率为97.72%，tr2+b1稀释300倍的抑菌率为97.46%，tr2+b2稀释100倍和300倍的抑菌率分别为97.78%和97.81%，tr3+b1稀释100倍和300倍的抑菌率分别为97.05%和95.31%，tr3+b2稀释100倍和300倍的抑菌率分别为98.06%和97.89%，b1+b2+tr1稀释100倍和300倍的抑菌率分别为96.32%和96.36%，b1+b2+tr2稀释100倍和300倍的抑菌率分别为97.75%和97.47%，b1+b2+tr3稀释100倍和300倍的抑菌率分别为97.00%和97.14%，tr1+tr2+b1稀释100倍和300倍的抑菌率分别为93.76%和94.18%，tr1+tr2+b2稀释100倍和300倍的抑菌率分别为94.74%和92.25%，tr1+tr3+b1稀释100倍和300倍的抑菌率分别为95.33%和94.70%，tr1+tr3+b2稀释100倍和300倍的抑菌率分别为96.05%和95.38%，tr2+tr3+b1稀释100倍和300倍的抑菌率分别为96.21%和95.57%，tr2+tr3+b2稀释100倍和300倍的抑菌率分别为95.25%和95.30%。
所述的抑菌率的计算公式为：
本发明具有如下的积极效果：采用本发明的试验方法，能够优先区分单一菌株（种）来源的生防菌剂在大田应用中存在的效果不稳定的情况，并通过对不同菌株（种）进行复配，试验增强其使用效果的稳定性，并通过试验数据分析，得出最佳抑菌率的菌种组合方式，有助于后期大田应用中更为准确的实施抑制烟草疫霉菌的预防和治疗工作，为获得高效稳定抑制烟草疫霉菌率的组合物提供可参照的试验方法。
具体实施方式
一种抑制烟草疫霉菌的试验方法，其方法如下：采用平板稀释涂布法分离烟草黑胫病发病烟田健康烟株根际土壤微生物，通过平板对峙试验筛选出烟草疫霉菌的拮抗细菌2株以及木霉菌3株；2株拮抗细菌编号分别为b1和b2，其单菌抑菌率均达80%以上，其中b1对烟草疫霉菌的抑制率达90%以上，经鉴定两者均为多粘类芽孢杆菌；3株木霉菌编号分别为ycs-tr1、ycs-tr2和ycs-tr3，其单抑菌率均达94%以上，经鉴定分别为绿木霉菌、近渐绿木霉菌和拟康宁木霉菌；
按照下述发酵条件对上述拮抗细菌以及木霉菌进行发酵处理，并得到物种发酵液：2株拮抗细菌的发酵培养基均为葡萄糖10g，豆粕10g以及mgso40.2g/l，发酵起始ph值为6～7，培养温度27℃，摇床转速180r/min，接种量1%，装液量200ml/500ml，培养时间为48h，活菌量均达108cfu/ml以上；3株木霉菌的发酵培养基均为为玉米粉25g、葡萄糖15g、玉米蛋白粉15g、nacl1.3g、mgso40.4g/l、k2hpo40.8g以及caco32g/l，培养温度27℃，发酵起始ph值为6，转速180r/min，接种量为6%，装瓶量150ml/500ml，发酵时间为9d，厚垣孢子数均达107个/ml；
将经过上述进行发酵处理后的3株木霉菌发酵液和2株拮抗细菌发酵液分别进行任意两种不同菌株之间1﹕1和任意三种不同菌株之间1﹕1﹕1组合，并将组合后的十五种组合物分别稀释100倍和300倍，取各稀释液200μl在pda平板上涂布，测量各处理疫霉菌菌丝生长量，并根据菌丝生长量计算生防菌室内抑菌效果，最终得到抑制烟草疫霉菌的最优抑菌效果。
所述的十五种组合物依次为：tr1+b1、tr1+b2、tr2+b1、tr2+b2、tr3+b1、tr3+b2、b1+b2+tr1、b1+b2+tr2、b1+b2+tr3、tr1+tr2+b1、tr1+tr2+b2、tr1+tr3+b1、tr1+tr3+b2、tr2+tr3+b1以及tr2+tr3+b2。
所述的tr1+b1稀释100倍的抑菌率为96.82%，tr1+b1稀释300倍的抑菌率为96.56%，tr1+b2稀释100倍的抑菌率为97.31%，tr1+b2稀释300倍的抑菌率为96.64%，tr2+b1稀释100倍的抑菌率为97.72%，tr2+b1稀释300倍的抑菌率为97.46%，tr2+b2稀释100倍和300倍的抑菌率分别为97.78%和97.81%，tr3+b1稀释100倍和300倍的抑菌率分别为97.05%和95.31%，tr3+b2稀释100倍和300倍的抑菌率分别为98.06%和97.89%，b1+b2+tr1稀释100倍和300倍的抑菌率分别为96.32%和96.36%，b1+b2+tr2稀释100倍和300倍的抑菌率分别为97.75%和97.47%，b1+b2+tr3稀释100倍和300倍的抑菌率分别为97.00%和97.14%，tr1+tr2+b1稀释100倍和300倍的抑菌率分别为93.76%和94.18%，tr1+tr2+b2稀释100倍和300倍的抑菌率分别为94.74%和92.25%，tr1+tr3+b1稀释100倍和300倍的抑菌率分别为95.33%和94.70%，tr1+tr3+b2稀释100倍和300倍的抑菌率分别为96.05%和95.38%，tr2+tr3+b1稀释100倍和300倍的抑菌率分别为96.21%和95.57%，tr2+tr3+b2稀释100倍和300倍的抑菌率分别为95.25%和95.30%。
所述的抑菌率的计算公式为：
本发明具有如下的积极效果：采用本发明的试验方法，能够优先区分单一菌株（种）来源的生防菌剂在大田应用中存在的效果不稳定的情况，并通过对不同菌株（种）进行复配，试验增强其使用效果的稳定性，并通过试验数据分析，得出最佳抑菌率的菌种组合方式，有助于后期大田应用中更为准确的实施抑制烟草疫霉菌的预防和治疗工作，为获得高效稳定抑制烟草疫霉菌率的组合物提供可参照的试验方法。
表1为发酵液对烟草疫霉菌的抑菌效果（两两混配）
表一
表2为发酵液对烟草疫霉菌的抑菌效果（三三混配）
表二
结果表明，真菌tr1与细菌b1或b2的两两组合后抑菌效果较单菌分别提高了约3.89%和15.1%，三者混合后的抑菌效果与两两混合后的效果相当；真菌tr3与细菌b1或b2的两两组合后抑菌效果较单菌分别提高了约4.63%和15.69%，三者混合后的抑菌效果与两两混合后的效果相比略有提高。