快速检测鲤浮肿病毒的RAA扩增引物和探针及检测试剂盒与使用方法与流程

本发明涉及水产养殖业水生动物疫病领域，尤其是一种快速检测鲤浮肿病毒的raa扩增引物和探针及检测试剂盒与使用方法。
背景技术：
：鲤浮肿病(carpedemavirusdisease，cevd)，也称锦鲤昏睡病(koisleepydisease,ksd)，是由一种痘病毒鲤浮肿病毒(carpedemavirus，cev)感染鲤、锦鲤引起的高度传染性流行病。患病鱼常出现烂鳃、凹眼、昏睡等症状，疾病导致的死亡率高达80-100％，给水产养殖业造成严重经济损失。该病已在全球迅速蔓延，我国在2016年首次报道发生cevd，是我国水生动物的一种新发疫病。目前对cev引起的鲤浮肿病尚无有效的治疗方法，只能以预防为主。因此建立准确、快速的现地检测方法，是有效防控cevd的保障。由于cev尚无易感细胞系，其检测方法主要依赖于套式pcr、荧光pcr等分子生物学方法。这些方法均需要昂贵的仪器设备、较高检测费用以及对检测人员较高的技术要求，难以满足非实验室等现场快速检测及基层普及应用。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是，提供一种快速检测鲤浮肿病毒的raa扩增引物和探针及检测试剂盒与使用方法，具有灵敏度高、特异性强、可视化、操作方法简单、无需昂贵设备等优点。为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种快速检测鲤浮肿病毒的raa扩增引物和探针，包含下述核苷酸序列的一对引物和探针：上游引物：raa-f：5’-agattgtagcatttcctagtttgtatggcaag-3’seqidno:1下游引物：raa-r：5’-gctctagttctaggattgtatgatgaaac-3’seqidno:2探针：probe：5’-aactctctttactgaaactccttgaggaatttgatctagaattccacagaa-3’seqidno:3。所述下游引物在5’端修饰biotin。所述探针的5’端标记fam，中间位置采用四氢呋喃thf替代一个碱基，3’端进行c3spacer处理。含有上述快速检测鲤浮肿病毒的raa扩增引物和探针的任一项检测鲤浮肿病毒试剂盒。所述试剂盒为重组酶介导扩增试剂盒，含有上述raa扩增引物和探针、核酸快速检测侧向流试纸条、鲤浮肿病毒p4a基因阳性对照样品和阴性对照样品、raa干粉试剂、水解缓冲液abuffer及醋酸镁溶液bbuffer。上述快速检测鲤浮肿病毒试剂盒的使用方法，包含以下步骤：(1)在raa冻干酶粉中加入40.9μl水解缓冲液abuffer，10μm、2μl鲤浮肿病毒上游引物seqidno:1，10μm、2μl鲤浮肿病毒下游引物seqidno:2，10μm、0.6μl鲤浮肿病毒探针seqidno:3，2μl模板，在反应管盖上加280mm、2.5μl醋酸镁bbuffer，上下颠倒反应管使之充分混匀后瞬离；恒温37℃反应10min；(2)反应：将步骤(1)恒温反应后的产物用核酸快速检测试纸条检测，3-5min观察结果；(3)结果判读：直接肉眼判读①阴性：仅在质控线出现条带，在检测线处无条带出现，说明所检测的样品没有鲤浮肿病感染；②阳性：质控线和检测线均出现条带，证明所检测的样品为鲤浮肿病感染；③无效：质控线和检测线均无条带出现，表明试验不成功，核酸快速检测试纸条失效。本发明的有益效果是：本发明的raa等温扩增体系，反应快速，温度范围宽，在34～40℃条件下均可实现靶基因的有效扩增，本发明的试剂盒能快捷、高效、灵敏的检测鲤浮肿病毒，具有操作简单，特异性高，且反应结果易于观察，安全无污染等特点，不仅为鲤浮肿病毒感染核酸的现场快速检测筛查提供有效的技术手段，同时对于控制鲤浮肿病毒在中国鲤和锦鲤感染传播及在疫区、出入境口岸的检验检疫也具有非常重要的意义。附图说明图1为cev的raa检测引物筛选的凝胶结果图(1：第一组引物；2：第二组引物；3：第三组引物；4：第四组引物)；图2为raa-lfd法对cev的灵敏度实验图(1.阴性对照；2-10为6.14×100-6.14×108的阳性标准品的扩增结果)；图3是本发明引物特异性测试图(1：阴性对照；2：鲤浮肿病毒p4a基因阳性质粒对照；3：锦鲤疱疹病毒(khv)核酸；4：金鱼造血器官坏死病毒(gfhnv)核酸；5：流行性造血器官坏死病毒(ehnv)核酸；6：蛙虹彩病毒(biv)核酸；7：斑点叉尾鮰病毒(ccv)核酸；8:对虾白斑综合征病毒(wssv)核酸；9:虾肝肠胞虫(ehp)核酸)。具体实施方式下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明：以下实施例中所用的材料、试剂等，无特殊说明，均为常规方法。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。以下实例中raa扩增试剂盒购自杭州众测生物科技有限公司。以下实例中便携式核酸快速检测侧向流试纸条(lfd)为杭州优思达生物技术有限公司产品。以下实例中病毒基因组dna提取试剂盒购自qiagen公司。以下实例中的引物及探针均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。以下实施例中的鲤浮肿病毒p4a基因阳性质粒根据genbank公布的p4a序列(528bp)进行合成并克隆在peasy-t1载体，作为本发明试剂盒的标准品。实施例1鲤浮肿病毒的raa-lfd快速检测试剂盒的建立1.鲤浮肿病毒的raa引物及探针的设计及合成以ncbi数据库中cevp4a基因保守区域为靶位点，依据raa引物设计原则，采用dnaman6.0软件进行序列比对分析，选取同源性高的片段，用primerprimer5.0设计了4对引物(如表1)。表1raa所用的引物：2.cevraa检测引物筛选以cev阳性质粒(6.14×106copies/μl)为模板进行扩增，反应结束后，用2％的琼脂糖电泳鉴定(见图1)，对设计引物进行筛选，筛选出最优引物对为第二组引物，其最优引物对为f及r：上游引物：cev-2-f：5’-agattgtagcatttcctagtttgtatggcaag-3’seqidno:1下游引物：cev-2-r:5’-gctctagttctaggattgtatgatgaaac-3’seqidno:23.cevraa-lfd试剂盒的建立本发明所述的cevraa-lfd试剂盒包括核酸检测试剂盒和核酸快速检测侧向流试纸条。本发明所述的核酸检测试剂盒，包括引物混合液、特异性探针、abuffer、bbuffer、raa干粉试剂、鲤浮肿病毒标准品和阴性样品。其中，所述的abuffer为20％peg；bbuffer为280mmmgac；raa干粉试剂的成分如下：1mmol/ldntp、90ng/μlssb蛋白、120ng/μlreca重组酶蛋白(sc-reca/bs-reca)或30ng/μlrad51、30ng/μlbsudna聚合酶，100mmol/ltricine、20％peg、5mmol/l二硫苏糖醇、100ng/μl肌酸激酶、nfo核酸外切酶、30ng/μlrte逆转录酶。本发明所述的引物混合液中，所述的上游引物碱基序列如seqidno:1所示，所述下游引物的碱基序列seqidno:2所示，上游引物和下游引物的摩尔配比为1:1。其中下游引物在5’端修饰biotin。raa-r：5’-biotin-gctctagttctaggattgtatgatgaaac-3’本发明提供的鲤浮肿病毒的特异性探针碱基序列如seqidno:3所示，探针的5’端标记fam，中间位置采用thf(四氢呋喃)替代一个碱基，3’端进行c3spacer处理。probe：5’-fam-aactctctttactgaaactccttgaggaattt[thf]atctagaattccacagaa-c3spacer本发明提供的鲤浮肿病毒标准品为鲤浮肿病毒p4a保守区基因序列的阳性质粒。实施例2利用实施例1所述鲤浮肿病毒raa-lfd快速检测试剂盒进行检测的方法1.组织预处理及dna抽提：取鲤或锦鲤的鳃和肾脏组织30-80mg，低温匀浆后按1:10比例添加pbs缓冲液或m199细胞培养液，冻融1次，1000r/min离心10min后，取200μl上清液，采用传统的酚-氯仿试剂或者采用等效的dna提取试剂盒进行dna抽提。2.鲤浮肿病毒raa反应体系的配置：每个检测样品对应一个raa反应干粉管，每个raa反应干粉管中各反应组分和所加入的体积如表2所示。表2：raa反应体系组分体积(μl)abuffer40.9引物混合液4特异性探针0.6dna模板2bbuffer2.5总体积50abuffer为20％peg；bbuffer为280mmmgac3.raa反应条件：将配置好反应体系的raa反应管放置在37℃水浴锅中，按照10min；4.试纸条检测：将扩增产物通过核酸快速检测侧向流试纸条装置检测。为防止反应产物产生的气溶胶影响检测结果，我们将50μlraa反应产物直接放置于装置内，与装置自带液泡缓冲液充分混合后竖立在水平操作台上，3-5min后观察并拍照记录结果。5.直接肉眼结果判读①阴性：仅在质控线(c线)出现条带，在检测线(t线)处无条带出现，说明所检测的样品没有鲤浮肿病感染；②阳性：质控线和检测线(c线和t线)均出现条带，证明所检测的样品为鲤浮肿病感染；③无效：质控线和检测线均无条带出现，表明试验不成功，核酸快速检测侧向流试纸条失效。实施例3本发明所述试剂盒的灵敏度试验本发明实施例1所述试剂盒提供的鲤浮肿病毒阳性质粒标准品，用nanodrop测定浓度，根据公式﹛质粒浓度(ng/μl)×10-9/[660×(质粒长度+载体长度)]﹜×6.023×1023＝质粒拷贝数(copies/μl)换算为其拷贝数。将质粒分别按照6.14×108至6.14×100拷贝/μl9个浓度梯度稀释，进行灵敏度试验。检测结果如图2所示，除阴性对照外，从左到右依次为6.14×100～6.14×108拷贝/μl的阳性标准品的扩增结果，从中可以看出本发明的raa-lfd灵敏度最低检测限6.14×100拷贝/μl，灵敏度优于普通pcr检测方法，与荧光pcr相当，表明本发明的raa-lfd快速检测试剂盒和检测方法对cev的诊断具有高度的灵敏性。实施例4本发明所述试剂盒的特异性试验为了检测本发明试剂盒的特异性，采用实施例2中的检测方法，分别对病毒khv、gfhnv、ehnv、biv、ccv、wssv、ehp阳性样本进行检测，分析本试剂盒对cev和其他水生动物常见dna病毒的检测情况。检测结果表明：仅cev样品出现正常扩增，阴性对照(depc处理水)及khv、gfhnv、ehnv、biv、ccv、wssv、ehp样品均未出现扩增(如图3所示)。上述结果说明，本发明raa-lfd快速检测试剂盒能特异性扩增出cev中的靶序列，而不与其他病毒核酸发生交叉反应。说明本发明方法及试剂盒特异性好。实施例5本发明raa-lfd快速检测试剂盒在临床实际应用中的评估利用本发明的raa-lfd方法和荧光定量pcr方法分别检测临床送检的疑似病料样品60份。检测结果显示raa-lfd检测出阳性样品49份，阴性样品11份，与荧光pcr结果完全一致，两种方法的阳性符合率为100％。相比于传统的pcr及荧光pcr，本发明操作更为简单，所需时间更短，对操作人员的技术要求不高；同时本发明的检测条件更适用于现场及基层鲤浮肿病筛查，能够方便、快捷、准确的对鲤浮肿病毒进行检测，可广泛地运用于仪器设备及实验条件较差的区域。本发明试剂盒，快速高效，整个扩增只需20-30min即可完成，扩增产量可以达到109个拷贝以上；操作简单，不需要特殊试剂，不需要预先进行双链dna的高温变性等繁琐步骤，只需要恒温的水浴锅或金属浴或培养箱，条件比较温和；高特异性，本发明对锦鲤疱疹病毒(khv)、金鱼造血器官坏死病毒(gfhnv)、流行性造血器官坏死病毒(ehnv)、蛙虹彩病毒(biv)、斑点叉尾鮰病毒(ccv)、对虾白斑综合征病毒(wssv)、虾肝肠胞虫(ehp)的dna均不发生扩增；高灵敏度，本发明的检测极限可以达到6.14×100拷贝/μl；鉴定简单，根据试纸条结果，肉眼直接判定结果，无需电泳、荧光定量等检测，适合现场检测。综上，本发明建立的raa检测方法不仅为鲤浮肿病毒感染核酸的现场快速检测筛查提供有效的技术手段，同时对于控制鲤浮肿病毒在中国鲤和锦鲤感染传播及在疫区、出入境口岸的检验检疫也具有非常重要的意义。综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有识之士在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发明的范围之内。sequencelisting<110>北京市水产技术推广站<120>快速检测鲤浮肿病毒的raa扩增引物和探针及检测试剂盒与使用方法<130><160>3<170>patentinversion3.5<210>1<211>32<212>dna<213>人工序列（artificialsequence）<400>1agattgtagcatttcctagtttgtatggcaag32<210>2<211>29<212>dna<213>人工序列（artificialsequence）<400>2gctctagttctaggattgtatgatgaaac29<210>3<211>51<212>dna<213>人工序列（artificialsequence）<400>3aactctctttactgaaactccttgaggaatttgatctagaattccacagaa51当前第1页12