OsDGD2β基因在培育雄性不育水稻品种中的应用的制作方法

本发明涉及植物基因工程和水稻分子育种技术领域，尤其涉及osdgd2β基因在培育雄性不育水稻品种中的应用。

背景技术：

稻米是最重要的谷物之一，世界一半以上的人口以稻米为主食。为满足人们对水稻产量和质量的要求日益增长，雄性不育系统的开发成为一种持续性需求。花药和花粉发育相关基因的突变往往导致不同形式的雄性不育，这有望成为杂交育种中母本的有用资源。水稻的杂种优势可以通过细胞质雄性不育(cms)的三系不育系或光温敏核雄性不育(ptgms)的两系不育系来实现。

然而，近期还出现了另一种利用核雄性不育技术生产杂交种子的新水稻育种体系。脂类及其衍生物对花粉的花药发育和繁殖至关重要，任何脂类合成基因的破坏都会导致花粉退化和/或败育，导致部分或完全雄性不育。据报道，水稻中的部分基因与绒毡层脂类的合成和分泌有关，如wda1、dpw、cyp70b2、fax1、osc6、tdr、gamyb等对花粉育性均至关重要。

半乳糖脂是高等植物甘油脂的一大类，mgdg和dgdg是所有光合生物中的两种半乳糖脂，分别占叶绿体脂质的50％和20％。这些半乳糖脂也参与了水稻花药和种子的发育。在植物中，半乳糖脂的合成是通过将一个来自udp-半乳糖的半乳糖添加到二酰甘油(dag)主链上，通过酶mgdg合成酶形成mgdg。同样地，通过dgdg合成酶将第二半乳糖转移到mgdg上从而合成dgdg。

目前，关于osdgd2β基因的研究还较少，对于其所具有的功能尚不清楚。

技术实现要素：

本发明提供了osdgd2β基因在培育雄性不育水稻品种中的新用途，雄性不育osdgd2β突变体可用于水稻核雄性不育系统的杂交育种和杂交种子生产，为培育雄性不育水稻品种提供的依据。

具体技术方案如下：

本发明提供了osdgd2β基因在培育雄性不育水稻品种中的应用，所述osdgd2β基因的核苷酸序列如seqidno.1所示；所述应用的途径为通过突变osdgd2β基因，使水稻突变体雄性不育。

进一步地，所述应用的途径为通过突变osdgd2β基因，改变水稻花药和花粉发育，导致花药和花粉的形态、大小和性状发生改变，从而使水稻突变体雄性不育。

本发明通过观察发现，自然状态下osdgdg2β突变体不能结实。进一步对突变体和野生型的花药、花粉和绒毡层的形态所做观察发现：野生型水稻的花药为鲜黄色，花粉呈圆形，碘染后颜色较深，而osdgdg2β突变体的花药为淡黄色，花药较小且收缩弯曲，花粉较少且不着色。还通过显微镜观测发现：在野生型水稻开花期的花药中，绒毡层几乎完全退化；与野生型相比，osdgdg2β突变体的花粉不仅未染色，体积更小且收缩弯曲，而且绒毡层仍然是一层厚的单层组织。通过透射电镜发现：野生型花粉含有淀粉颗粒等成分，而突变型花粉则完全不含淀粉颗粒。由此证明，osdgdg2β突变体雄性不育。

为了进一步评估osdgdg2β突变对雌蕊育性是否存在影响，本发明通过对突变体人工去雄、套袋，而后授以野生型花粉的方式，发现osdgdg2β突变体的杂交穗可正常结实，证明osdgdg2β突变体是雌性可育的。

由上述实验结果证明，osdgdg2β突变体为雄性不育而雌性可育，可用于水稻核雄性不育系统的杂交育种和杂交种子生产。

此外，本发明还经研究发现：在水稻中，dgdg的合成由5个基因编码，分别为osdgd1a、osdgd1β、osdgd1δ、osdgd2a和osdgd2β；而osdgd2β是唯一一个在花药中高度表达的dgdg合成酶基因。

本发明还提供了一种培育雄性不育水稻品种的方法，包括以下步骤：

(1)设计osdgd2β基因的靶序列，构建crispr/cas9载体；所述靶序列的核苷酸序列如seqidno.2所示；

(2)构建含步骤(1)所述crispr/cas9载体的基因工程菌；

(3)将步骤(2)所述基因工程菌转至水稻的成熟种子愈伤组织中，获得再生植株。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了通过osdgd2β基因突变培育雄性不育水稻材料的新途径。利用诸如crispr/cas9基因编辑技术创制的osdgd2β基因缺失突变体雄性稳定不育，但对雌性育性以及其它性状(如光合作用)没有负面影响，使其在杂交育种和杂种优势利用中具有独特的优势。

附图说明

图1为实施例1中利用crispr/cas9系统对osdgd2β的靶标突变；

其中，xidao#1为野生型，osdgd2β-1为1-bp缺失的纯合突变体，osdgd2β-2为同时2-bp缺失和5-bp缺失的双突变体；

a为osdgd2β基因含靶标区域的两个转录本，；

b为含pam的靶标区域dna序列和基因组特定sgrna序列；

c为突变体截断蛋白示意图，glycos_transf_1代表独有域。

图2为实施例2中开花当天野生型xidao#1(a)和突变体osdgd2β-1(b)的稻穗比较；

其中，a为野生型xidao#1；b为突变体osdgd2β-1；c为osdgd2β-1败育突变体接受野生型花粉授粉15天后的结实情况。

图3为实施例2中通过1％i-ki花粉染色对去内稃小穂花药差异的观察图；

其中，xidao#1为野生型，osdgd2β-1为1-bp缺失的纯合突变体，osdgd2β-2a为同时2-bp缺失和5-bp缺失的双突变体。

图4为实施例2中0.5％甲苯胺蓝染色的花药横切面显微镜(上)和放大4000x的透射电子显微镜(下)的观察图；

其中，xidao#1为野生型，osdgd2β-1为1-bp缺失的纯合突变体，osdgd2β-2a为同时2-bp缺失和5-bp缺失的双突变体；e代表表皮，t代表绒毡层，p代表花粉。

图5为实施例3中野生型锡稻1号与突变体osdgd2β-1和osdgd2β-2的叶和花药中dgdg合成基因的相对表达量；

其中，a为叶片部，b为花药部位；osdgd1α,osdgd1β,osdgd1δ,osdgd2α和osdgd2β为水稻中dgdg的合成基因。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围不仅限于此。

实施例1突变体的构建和鉴定

1、突变体的构建

利用crispr载体phun4c12构建靶向osdgd2β突变的基因组编辑载体，通过crispr-p1.0设计靶向osdgd2β第三外显子的特异靶标序列(genomespecificsgrnasequence:aggtcaatagtttgcaatg)，并合成寡核苷酸链(d2b-t/-b)(d2b-t:ggcacattgcaaactattgacct，d2b-b:aaacaggtcaatagtttgcaatg)；用退火缓冲液将寡核苷酸链结合，用bsai-hf(neb)酶切phun4c12载体，并利用t4连接酶与寡核苷酸双链连接。连接好的载体，即命名为phun4c12s:osdgd2β，并将其转化至dh5α大肠杆菌感受态中，插入的sgrna通过测序引物(seq-f):gcccattacgcaattggacg进行测序验证。

将重组载体转至农杆菌(eha105)中，并利用农杆菌介导法进一步将其转至粳稻品种锡稻1号成熟种子愈伤组织中，重组载体插入植物基因组中后表达产生sgrna和cas9核酸酶，通过sgrna与靶标序列配对的引导，从而该靶向的植物基因组将被cas9核酸酶切开产生双链断裂，基因组在修复过程中发生错误，从而得到2个osdgd2β突变体(分别为osdgd2β-1、osdgd2β-2)(如图1所示)。

2、鉴定突变体

利用ctab法提取osdgd2β突变体的叶片dna，使用pcr引物d2b-f/-r；其中，d2b-f：tcaagttatggcattttccgtct，d2b-r：gcacccttgaagaatgcttgt对转化单株的目标区域进行扩增和测序检测。

将双等位突变体osdgd2β-2的目标片段克隆至载体，转化至大肠杆菌并测序验证。通过expasy(http://web.expasy.org/translate/)翻译工具分析蛋白序列。种植t0代突变单株，并在开花后将分蘖分开种植，用于后续研究。

实施例2突变体的表型特征

1、花药结构和花粉育性的研究

在t0代突变体osdgd2β和野生型的抽穗当天，收集小穂于加有固定剂faa(福尔马林/乙酸/酒精)离心管中，并在室温下保存。在普通显微镜下观察突变体osdgd2β和野生型的花和花药结构，并在复合显微镜下观察1％iki染色的花粉育性。

如图2所示，在开花期，突变体叶鞘圆锥花序与野生型相比未完全外露。而且，与开花时野生型相比，突变体中大多数小穗的花药未外露(图2b)。此外，为了评估该突变体是否影响雌蕊育性，进行了突变体去雄，之后以野生型为父本杂交。结果表明，这些杂交穗可正常结实，突变体是雌性可育的(图2c)。

显微镜检测表明(如图3)，突变体的花药和花粉较野生型有轻浅的染色、变小和收缩(图3a)。在野生型中，绒毡层几乎完全退化；而在突变体中，绒毡层仍然是为厚的单层组织(图3a和b)。

2、切片处理

通过透视显微镜tem对两个突变体osdgd2β和野生型的花药进行切片处理和观察，具体步骤如下：

两个突变体osdgd2β和野生型的花药被2.5％戊二醛磷酸盐缓冲盐水(pbs,0.1mph7.0)浸泡4小时以上，用1％四氧化锇再固定2小时以上，随后用pbs冲洗。先用梯度乙醇(30％,50％,70％,80％,90％,95％and100％)，然后用纯丙酮，最后使用丁香树脂将花药进行脱水，并利用具玻璃刀的超微切片机，获得2μm半薄切片，用0.5％甲苯胺蓝染色，在显微镜下观察。利用leicaemuc7u切片机获得100nm超薄切片，分别用乙酸双氧铀和碱性柠檬酸铅染色5-10分钟，并于透射电子显微镜下观察。

透射电镜下花粉粒观测(如图4)显示：野生型花粉含有淀粉粒等成分，而突变型花粉则完全没有淀粉粒(图4b)；突变体花药中的绒毡层显示程序性细胞死亡有所延迟。

实施例3基因表达分析

在开花当天收集突变体osdgd2β和野生型的叶片和花药，用rna提取试剂盒提取总rna，使用反转录试剂盒将rna反转录，用hieff^tmqpcr反应混合物进行qrt-pcr试验。

试验进行了三次生物学重复和三次技术重复，osactin作为内参，通过2^-δδct分析方法计算基因的相对表达量水平，引物如表1所示。

表1引物序列

如图5所示，突变体的叶片和花药中osdgd2β均显著降低，分别降低了约65.26％和88.62％，其他dgdg合成基因在叶片中均与野生型无显著差别(图5a)，而在花药中除了osdgd2α外均与野生型存在显著性差异(图5b)。在两个突变体osdgd2β中，osdgd1δ，，osdgd1β和osdgd1α表达量分别升高了5.9倍、2.1倍和1.8倍。

序列表

<110>浙江大学

<120>osdgd2β基因在培育雄性不育水稻品种中的应用

<160>19

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>3676

<212>dna

<213>水稻(oryza.satival.)

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