本发明属于生物医药领域，具体涉及采用产紫青霉(penicilliumpurpurogenum)sc0070生产二聚四氢xanthone类化合物的方法；本发明还涉及该类化合物在制备抗菌剂、细胞增殖抑制剂或抗肿瘤剂中的用途。
背景技术：
xanthone类化合物又称苯并色原酮、二苯基-γ-吡喃酮或氧杂蒽酮，其基本母核具有一个线性排列的三环对称结构。其中，苯环氢化形成的四氢xanthone类化合物，具有多个手性中心以及不同的二聚方式，从而四氢xanthone二聚体呈现丰富的结构多样性和显著的生物活性。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一类真菌来源的二聚四氢xanthone类化合物及其制备方法和应用。
本发明在研究产紫青霉(penicilliumpurpurogenum)sc0070代谢产物及其抗菌、抗肿瘤活性的过程中，通过柱层析、高效液相色谱层析等分离纯化方法，得到四个新的二聚四氢xanthone类化合物，抑菌试验表明这些化合物对金黄色葡萄球菌(mssa)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)和痢疾志贺菌(shigelladysenteria)有显著的抑制作用，体外抗肿瘤试验表明这些化合物对肿瘤细胞株人肺癌细胞a549、人宫颈癌细胞hela、人肝癌细胞hepg有显著的细胞毒活性，对正常细胞非洲绿猴肾细胞vero具有选择性，从而实现了本发明的目的。
本发明的第一个目的是提供一类新的二聚四氢xanthone类化合物，其特征在于，结构如式(i)表示：
本发明的第二个目的是提供上述二聚四氢xanthone类化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
所述的二聚四氢xanthone类化合物是从产紫青霉(penicilliumpurpurogenum)sc0070的发酵培养物中分离得到的。
优选，具体步骤如下：
将产紫青霉(penicilliumpurpurogenum)sc0070用小麦固体培养基发酵得到发酵产物，发酵培养物用乙醇浸提，乙醇提取物减压浓缩至浸膏状得浸膏，用水分散后，依次用氯仿、乙酸乙酯和正丁醇分步萃取，分别将氯仿和乙酸乙酯萃取部分浓缩后，分别用硅胶柱层析，以氯仿/甲醇为溶剂进行梯度洗脱100:0～70:30v/v，合并后的流分经纯化得到式(i)中化合物1、化合物2、化合物3和化合物4。
所述的小麦固体培养基是：每50g小麦加入50mlymg培养基得到，所述的ymg培养基，每1l水含有4g葡萄糖、10g麦芽提取物、4g酵母提取物。
进一步优选，具体步骤如下：
将发酵培养物用体积分数95％乙醇水溶液浸提，乙醇提取物减压浓缩至浸膏状得浸膏，用水分散后，依次用氯仿、乙酸乙酯和正丁醇分步萃取，得到氯仿萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；
将氯仿萃取物用硅胶柱层析，以氯仿/甲醇为溶剂进行梯度洗脱100:0～70:30v/v，合并得到8个流份c1～c8，其中氯仿/甲醇90:10v/v洗脱部分流分c2通过c18反相硅胶柱层析，用甲醇/水混合溶剂作为洗脱剂，洗脱梯度：甲醇/水10:90～100:0，v/v，根据tlc分析结果，合并得到12个流份c2.1～c2.12，tlc分析展开剂：氯仿/甲醇95:5，rf＝0.45的为流份c2.7，经重结晶得到化合物2；tlc分析展开剂：氯仿/甲醇90:10，rf＝0.35的为流分c2.9，其用凝胶柱sephadexlh-20层析分离，以甲醇为洗脱溶剂，并进一步利用制备c18-hplc，以体积分数41％甲醇/水为洗脱剂，流速5ml/min，纯化得到化合物3，tr＝43.6min；
乙酸乙酯萃取物用硅胶柱层析，以氯仿/甲醇为溶剂进行梯度洗脱100:0～70:30v/v，合并得到11个流份e1～e11，氯仿/甲醇94:6v/v洗脱部分流分e4通过c18反相硅胶柱层析，用甲醇/水混合溶剂作为洗脱剂，洗脱梯度：甲醇/水10:90～100:0，v/v，根据tlc分析结果，合并得到9个流份e4.1～e4.9，其中tlc分析展开剂：氯仿/甲醇95:5，rf＝0.55的流分e4.5依次采用凝胶柱sephadexlh-20层析，以甲醇为洗脱溶剂，制备薄层层析，展开剂氯仿/甲醇＝95/5v/v，rf＝0.46的流份经重结晶得到化合物1；而tlc分析展开剂：氯仿/甲醇95:5，rf＝0.40的流分e4.6依次通过凝胶柱sephadexlh-20层析，以甲醇为洗脱溶剂，和制备c18-hplc，以体积分数41％甲醇/水为流动相，流速5ml/min，得到化合物4，其tr＝52.5min。
本发明的第三个目的是提供产紫青霉(penicilliumpurpurogenum)sc0070在制备上述二聚四氢xanthone类化合物中的应用。
本发明的第四个目的是提供上述二聚四氢xanthone类化合物或其盐在制备抗菌药物、细胞增殖抑制剂和/或抗肿瘤药物中的应用。
所述的抗菌药物优选为抗金黄色葡萄球菌(mssa)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)和/或痢疾志贺氏菌shigelladysenteriae的药物；所述的抗肿瘤药物是抗人肺癌、人宫颈癌和/或人肝癌细胞的药物。
本发明的第五个目的是提供一种抗菌药物或抗肿瘤药物，其特征在于，含有上述任一四氢xanthone二聚体类化合物或其药用盐作为活性成分。
所述的抗菌药物优选为抗金黄色葡萄球菌(mssa)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)和/或痢疾志贺氏菌shigelladysenteriae的药物；所述的抗肿瘤药物是抗人肺癌、人宫颈癌和/或人肝癌细胞的药物。
本发明从产紫青霉(penicilliumpurpurogenum)sc0070发酵产物中分离得到四个新的二聚四氢xanthone类化合物，抑菌试验表明这些化合物对金黄色葡萄球菌(mssa)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)和痢疾志贺菌(shigelladysenteria)有显著的抑制作用，体外抗肿瘤试验表明这些化合物对肿瘤细胞株人肺癌细胞a549、人宫颈癌细胞hela、人肝癌细胞hepg具有显著的细胞毒活性，同时对正常细胞非洲绿猴肾细胞vero具有选择性，该类化合物可以用于医药中作为抗菌剂、细胞增殖抑制剂或抗肿瘤药物。
本发明的产紫青霉(penicilliumpurpurogenum)sc0070公开于文献：jinghuaxue,pingwu,liangxiongxu,xiaoyiwei.penicillitone,apotentinvitroanti-inflammatoryandcytotoxicrearrangedsterolwithanunusualtetracyclecoreproducedbypenicilliumpurpurogenum.org.lett.,2014,16(5),1518–1521中。该菌株本申请人也持有，保证自申请日起20年内向公众提供。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实验中所用溶剂氯仿、甲醇、石油醚、乙酸乙酯、乙醇、正丁醇等为广州试剂二厂和天津富宇试剂公司生产，均为分析纯。薄层硅胶层析板为烟台黄务硅胶开发试验厂生产。旋转蒸发仪为eyelan-1001，eyelaa-1000s型循环水真空泵，eyelaca-1111型低温冷却液循环泵。电热恒温水浴锅为上海精宏实验设备有限公司生产。制备hplc：泵为shimadzulc-6ad、检测器shimadzurid-10a、ymc-packods-ac18层析柱(5μm,250×20mm)。hresi-ms仪器为brukerbiotofiiiq质谱仪。nmr谱用brukeravance600型超导核磁共振仪测定，以氘代溶剂作标定。各种氘代试剂为美国剑桥公司(cil)生产。
实施例1
将产紫青霉(penicilliumpurpurogenum)sc0070菌株接种在小麦固体培养基(每50g小麦加入到50mlymg培养基，混合均匀后灭菌所得。所述的ymg培养基，其配制方法为：将4g葡萄糖、10g麦芽提取物、4g酵母提取物溶于1l水中)，25℃无光照条件下静置培养16天，得到固体发酵培养物。
将固体发酵培养物用体积分数95％乙醇水溶液浸提3次，每次48h，乙醇提取物减压浓缩至浸膏状得浸膏，用适量水分散后，依次用氯仿、乙酸乙酯和正丁醇分步萃取。将氯仿萃取物，用硅胶柱层析，以氯仿/甲醇为溶剂进行梯度洗脱(100:0～70:30v/v)，合并得到8个流份c1～c8，其中流分c2(氯仿/甲醇90:10v/v洗脱部分)通过c18反相硅胶柱层析，用甲醇/水混合溶剂作为洗脱剂(洗脱梯度：甲醇/水10:90～100:0，v/v)，根据tlc分析结果，合并得到12个流份c2.1～c2.12，化合物2通过重结晶从c2.7(tlc分析展开剂：氯仿/甲醇95:5，rf＝0.45)中纯化得到，流分c2.9(tlc分析展开剂：氯仿/甲醇90:10，rf＝0.35)用凝胶柱sephadexlh-20层析分离(以甲醇为洗脱溶剂)，并进一步利用制备c18-hplc(体积分数41％甲醇/水，流速5ml/min)纯化得到化合物3(tr＝43.6min)。类似的，乙酸乙酯萃取物，用硅胶柱层析，以氯仿/甲醇为溶剂进行梯度洗脱(100:0～70:30v/v)，合并得到11个流份e1～e11，流分e4(氯仿/甲醇94:6v/v洗脱部分)通过c18反相硅胶柱层析，用甲醇/水混合溶剂作为洗脱剂(洗脱梯度：甲醇/水10:90～100:0，v/v)，根据tlc分析结果，合并得到9个流份e4.1～e4.9，其中流分e4.5(tlc分析展开剂：氯仿/甲醇95:5，rf＝0.55)依次采用凝胶柱sephadexlh-20层析(以甲醇为洗脱溶剂)，制备薄层层析(展开剂氯仿/甲醇＝95/5v/v，rf＝0.46)和重结晶得到化合物1，而流分e4.6(tlc分析展开剂：氯仿/甲醇95:5，rf＝0.40)依次通过凝胶柱sephadexlh-20层析(以甲醇为洗脱溶剂)和制备c18-hplc(体积分数41％甲醇/水，流速5ml/min)得到化合物4(tr＝52.5min)。
化合物1的结构鉴定数据如下:
化合物2的结构鉴定数据如下:
化合物3的结构鉴定数据如下:
化合物4的结构鉴定数据如下:
表1化合物1和2的核磁数据(测试溶剂为cdcl3)
表2化合物3和4的核磁数据(测试溶剂为cdcl3)
综合以上结果，由此鉴定确认分离到的化合物1、化合物2、化合物3和化合物4分别对应为式(i)所示的二聚四氢xanthone类化合物。
即化合物1、2、3和4的结构如式(i)表示：
实施例2抑菌实验
用金黄色葡萄球菌(mssa)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)和痢疾志贺菌(shigelladysenteria)作为测试菌株，用25ml的mhb培养基在37℃、150rpm的摇床上培养12h，用mhb调整各菌悬液的浓度为1×105cfu/ml。以dmso溶解各测试样品(化合物1–3)并稀释为所需的浓度，各测试样品的终浓度为：200、100、50、25、12.5、6.25、3.125和1.5625ug/ml。设置相同浓度的dmso代替测试样品作为阴性对照，用alamarblue不含菌悬液作为空白对照，卡拉霉素、万古霉素分别作为阳性对照。在96孔板中加入100μl的菌悬液其中包含alamarblue(8％，v/v)和稀释好的各测试样品(4％，v/v)，每个处理三个重复，在37℃黑暗条件下孵育。当孔内颜色从粉色变为蓝色，在570nm下测定每孔的od值。mic定义为从粉红色变为蓝色的最低样品浓度，实验结果如表3所示。
表3化合物1–3的抑菌活性
实施例3体外抗肿瘤实验
取对数生长的细胞株人肺癌细胞a549、人宫颈癌细胞hela、人肝癌细胞hepg2和非洲绿猴肾细胞vero加入96孔板中，每孔含有约5000个细胞。再加入不同浓度的化合物，并以阿霉素为阳性对照，以未加样品的细胞孔作为对照组，每组设4个平行孔，置于二氧化碳培养箱中37℃培养72小时，实验终止前4小时加入20μlmtt(5mg/ml)溶液，再培养4小时，弃去培养液后加入150μldmso，待结晶溶解后在酶联检测仪上检测570nm波长下每孔的od值。按下列公式求出生长抑制率，再由spss(17.0)软件求出半数抑制浓度(ic50值)，实验结果如表4所示，其中ic50用mean±s.e.m表示。
表4化合物1–3的细胞株毒性