能促进较大基因表达的Bcl2突变体及应用的制作方法

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种能促进大于4.3kb基因表达的bcl2突变体及应用。

背景技术：

bcl2基因是一个能抗细胞凋亡的基因，目前被用于基因治疗的体内筛选和生物制药中增加重组蛋白表达等。经研究发现，当把小鼠bcl2的第69位的苏氨酸(t)、第70和84位(人bcl2为第87位)的丝氨酸(s)突变为谷氨酸(e)(这三个位点氨基酸突变为谷氨酸的小鼠bcl2为bcl2^{t69e/s70e/s84e}，人的bcl2为bcl2^{t69e/s70e/s87e})，模拟在这三个位点磷酸化，就可显著提高bcl2的抗凋亡能力，因此磷酸化的bcl2蛋白也被应用于增加重组蛋白的表达量。但是对于目的重组蛋白基因比较大的(大于4.3kb，比如凝血因子viii基因)基因，因为mrna不稳定的原因，表达量比较低，影响了工业化生产这种大小的重组蛋白质。对于这种蛋白质，即使把其基因与模拟磷酸化的bcl2构建在同一表达质粒进行共表达也对促进其表达效果不明显。

技术实现要素：

本发明的一个目的是针对现有技术的不足，提供一种能促进大于4.3kb基因表达的bcl2突变体。

本发明提供的技术方案：

本发明bcl2突变体为在小鼠bcl2基因的第190位密码子由gga突变为终止密码子tga，或人bcl2基因的第193位密码子由gga突变为终止密码子tga。

即在小鼠bcl2基因的第568位碱基(人bcl2相应的为577位)，野生型的为g，只要把其突变为t，从而使得190位密码子(人相应为193位密码子)由gga变为终止密码子tga，也就是把bcl2从189位(人为192位)后切除其尾巴，即可使bcl2获得促进大于4.3kb基因表达的能力。当该bcl2突变体与大于4.3kb目的基因构建于同一表达质粒共表达时，就可大大促进目的基因的表达。

作为优选，本发明bcl2突变体还包括小鼠bcl2基因的第69位的苏氨酸残基(t)突变为谷氨酸残基(e)、第70位的丝氨酸残基(s)突变为谷氨酸残基(e)、第84位的丝氨酸残基(s)突变为谷氨酸残基(e)；或人bcl2基因的第69位的苏氨酸残基(t)突变为谷氨酸残基(e)、第70位的丝氨酸残基(s)突变为谷氨酸残基(e)、第87位的丝氨酸残基(s)突变为谷氨酸残基(e)。

本发明的另一个目的是将上述新型bcl2突变体和目的基因构建在能同时表达双基因的载体质粒上的应用。上述目的基因大于4.3kb。

作为优选，新型bcl2突变体连接在内部核糖体进入位点(internalribosomeentrysite,ires)下游，把目的基因连接在ires上游。

所述的大于4.3kb目的基因包括b区域删除的凝血因子八(bddfviii)、全长凝血因子八(fviii)。

本发明的有益效果是：

本发明通过突变第568位(人bcl2基因为577位)碱基，使g变为t，把该经过突变的磷酸化bcl2与目的重组蛋白基因构建于双顺反子的表达载体上，就可以促进大于4.3kb的目的重组蛋白基因的表达。

附图说明

图1a为构建有gfp-bddfviii或者bddfviii或者fviii基因和小鼠bcl2或人bcl2(标记为hbcl2)突变体基因的逆转录病毒载体质粒示意图。

图1b为仅构建有bddfviii或者fviii基因的逆转录病毒载体质粒示意图。

图2在hek293细胞转染pmigr1-△bcl2^eee-gfp-bddfviii、pmigr1-bcl2^eee-gfp-bddfviii和pmigr1-bcl2^wt-gfp-bddfviii逆转录病毒表达载体质粒后54小时的gfp荧光显微图。其中图2a、图2b分别为转染pmigr1-△bcl2^eee-gfp-bddfviii逆转录病毒表达载体质粒后54小时的细胞生长图和gfp荧光显微图；图2c、图2d分别为转染pmigr1-bcl2^eee-gfp-bddfviii逆转录病毒表达载体质粒后54小时的细胞生长图和gfp荧光显微图；图2e、图2f分别为转染pmigr1-bcl2^wt-gfp-bddfviii逆转录病毒表达载体质粒后54小时的细胞生长图和gfp荧光显微图。从图中可以看出，转染pmigr1-△bcl2^eee-gfp-bddfviii的细胞中gfp阳性细胞最多并且荧光强度最强，而转染pmigr1-bcl2^eee-gfp-bddfviii和pmigr1-bcl2^wt-gfp-bddfviii的细胞中gfp阳性细胞和荧光强度显著减低了。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的分析。

实施例1：点突变bcl2

小鼠bcl2cdna和人bcl2cdna分别克隆于pmigr1质粒的ncoi和sali之间，即在内部核糖体进入位点(ires)下游，见图1。利用点突变试剂盒(transformer,clontech)，把第568位(人bcl2为第577位)核苷酸g突变成t，使对应于第190位(人bcl2相应为193位密码子)的甘氨酸残基密码子gga换成终止密码子tga。通过对cdna测序进行验证突变点，验证正确无误后，即得到所需要的去掉尾部47个氨基酸残基的突变bcl2(△bcl2)的基因序列，包含有该△bcl2质粒为pmigr1-△bcl2(包含人△bcl2的质粒为pmigr1-△hbcl2)。再通过同样的方法把对应于第69位的苏氨酸残基t密码子和第70位、84位(人bcl2对应的为第87位)的丝氨酸残基s密码子突变成谷氨酸残基e密码子，每个突变点通过对cdna测序进行验证，验证正确无误后，即得到所需要的t69e/s70e/s84e(人bcl2为t69e/s70e/s87e)并去掉尾部47个氨基酸残基的模拟磷酸化的突变小鼠bcl2(△bcl2^eee)和突变人bcl2(△hbcl2^eee)的基因序列，包含有该△bcl2^eee和△hbcl2^eee质粒分别为pmigr1-△bcl2^eee和pmigr1-△hbcl2^eee。以没有去尾部氨基酸残基的野生型小鼠bcl2(bcl2^wt)和人bcl2(hbcl2^wt)和模拟磷酸化的突变小鼠bcl2(bcl2^eee)和人bcl2(hbcl2^eee)构建的pmigr1-bcl2^wt、pmigr1-hbcl2^wt和pmigr1-bcl2^eee、pmigr1-hbcl2^eee作为对照质粒。

实施例2：构建含有上述点突变小鼠bcl2和大于4.3kb基因的双顺反子逆转录病毒表达载体

取pmigr1质粒进行bglii/sali酶切，酶切完再用琼脂糖凝胶电泳分离提纯pmigr1酶切片段；合成5’gatctctcgaggcggccgccaattgg3’和5’tcgaccaattggcggccgcctcgaga3’，退火后与pmigr1酶切片段进行连接，以导入多克隆酶切位点bglii-xhoi-noti-muni-sali，连接好后转化大肠杆菌jm109，在含有氨苄青霉素的琼脂糖培养皿中进行筛选培养，对阳性大肠杆菌克隆进行扩增培养，然后提取纯化质粒。然后进行测序验证序列是否正确，验证后即得pmigr1-△gfp质粒。

以pmigr1质粒为模板，pcr扩增gfp基因，在5’端引物中引入bglii酶切位点和kozak序列gccacc，在3’端引物中保留sali酶切位点。pcr后提纯pcr产物，然后用bglii/sali进行酶切，酶切完再用琼脂糖凝胶电泳分离提纯gfp片段。另以hsq/avrii/reneo质粒为模板，pcr扩增b区域删除的凝血因子八(bddfviii)基因，5’端引物保留xhoi酶切位点，3’端引物引入muni酶切位点。pcr后提纯pcr产物，然后用xhoi/muni进行酶切，酶切完再用琼脂糖凝胶电泳分离提纯bddfviii片段。全长人凝血因子八(fviii)通过合成获得，两端引入xhoi/muni酶切位点，用xhoi/muni酶切，酶切完再用琼脂糖凝胶电泳分离提纯fviii片段。pmigr1-△bcl2^eee、pmigr1-bcl2^eee和pmigr1-bcl2^wt用bglii/ecori和xhoi/ecori切开多克隆酶切位点，pmigr1-△hbcl2^eee、pmigr1-hbcl2^eee和pmigr1-hbcl2^wt用xhoi/ecori切开多克隆酶切位点，pmigr1-△gfp用xhoi/muni切开多克隆酶切位点，琼脂糖胶电泳进行分离纯化。把上述分离纯化好的gfp基因片段、bddfviii基因片段分别与bglii/ecori切开的三个质粒片段放在一起进行连接反应；另把bddfviii或fviii基因片段分别与xhoi/ecori切开的六个质粒片段以及xhoi/muni切开的pmigr1-△gfp质粒片段放在一起进行连接反应。连接好后转化大肠杆菌jm109，在含有氨苄青霉素的琼脂糖培养皿中进行筛选培养，对阳性大肠杆菌克隆进行扩增培养，然后提取纯化质粒。然后进行测序验证序列是否正确，验证后即得pmigr1-△bcl2^eee-gfp-bddfviii、pmigr1-△bcl2^eee-bddfviii、pmigr1-△bcl2^eee-fviii、pmigr1-△hbcl2^eee-fviii逆转录病毒表达载体质粒以及对照pmigr1-bcl2^eee-gfp-bddfviii、pmigr1-bcl2^eee-bddfviii、pmigr1-bcl2^eee-fviii和pmigr1-bcl2^wt-gfp-bddfviii、pmigr1-bcl2^wt-bddfviii、pmigr1-bcl2^wt-fviii、pmigr1-hbcl2^eee-fviii、pmigr1-hbcl2^wt-fviii逆转录病毒表达载体质粒(见图1a)和pmigr1-△gfp-bddfviii、pmigr1-△gfp-fviii逆转录病毒表达载体质粒(见图1b)，其中目的基因大小均超过4.3kb。

实施例3：转染hek293细胞并表达大于5kb的融合基因gfp

取二块六孔细胞培养板，在其中九孔中进行人胚肾来源的hek293细胞培养，具体培养基为dmem添加15％胎牛血清、2mml-谷氨酰胺、100单位/毫升青霉素、100微克/毫升链霉素(配好的培养基为完全培养基)。把hek293细胞培养于该培养基中，在37℃、5％二氧化碳浓度的培养箱中培养，等到细胞在培养皿中70-80％汇合(confluent)后，用仅含有5％胎牛血清的dmem培养基洗两遍，然后每孔加入2毫升仅含5％胎牛血清的dmem培养基，放在培养箱中待用。分别取上述提纯好的pmigr1-△bcl2^eee-gfp-bddfviii、pmigr1-bcl2^eee-gfp-bddfviii和pmigr1-bcl2^wt-gfp-bddfviii逆转录病毒表达载体质粒各15微克，分别溶解于装于3个1.5毫升eppendof管的750微升的opti-mem培养基中，混匀；另取3个1.5毫升的eppendof管，每管加750微升的opti-mem培养基，然后在每管opti-mem培养基加入invitrogen公司的lipofactamine2000脂质体30微升，混匀。室温放置五分钟。然后把溶有dna的opti-mem溶液与溶有脂质体的opti-mem溶液混合在一起，混匀，室温放置20分钟。从培养箱中取出细胞，每三孔重复转染一种dna质粒，即每孔细胞中加入已经混匀室温放置20分钟的dna脂质体混合液500微升，轻轻摇匀，置于细胞培养箱中进行培养。六小时后，每孔换新鲜的完全培养基2.5毫升，继续培养24小时，再换新鲜完全培养基2.5毫升/孔，培养24小时后上荧光显微镜观察gfp蛋白表达量。gfp表达量见附图2，图中显示，经过了第568位(人bcl2为第577位)核苷酸g突变成t，使对应于第190位(人bcl2相应为193位密码子)的甘氨酸残基密码子gga换成终止密码子tga后，△bcl2^eee与连接了bddfviii基因的gfp在一个mrna链共表达后，能极大促进该gfp的表达。

实施例4转染hek293细胞并表达bddfviii和fviii基因

取四块六孔细胞培养板，进行人胚肾来源的hek293细胞培养，具体培养基为dmem添加15％胎牛血清、2mml-谷氨酰胺、100单位/毫升青霉素、100微克/毫升链霉素(配好的培养基为完全培养基)。把hek293细胞培养于该培养基中，在37℃、5％二氧化碳浓度的培养箱中培养，等到细胞在培养皿中70-80％汇合(confluent)后，用仅含有5％胎牛血清的dmem培养基洗两遍，然后每孔加入2毫升仅含5％胎牛血清的dmem培养基，放在培养箱中待用。分别取上述提纯好的pmigr1-△bcl2^eee-bddfviii、pmigr1-bcl2^eee-bddfviii和pmigr1-bcl2^wt-bddfviii、pmigr1-△hbcl2^eee-fviii、pmigr1-hbcl2^eee-fviii、pmigr1-hbcl2^wt-fviii、pmigr1-△gfp-bddfviii、pmigr1-△gfp-fviii逆转录病毒表达载体质粒各15微克，分别溶解于装于3个1.5毫升eppendof管的750微升的opti-mem培养基中，混匀；另取3个1.5毫升的eppendof管，每管加750微升的opti-mem培养基，然后在每管opti-mem培养基加入invitrogen公司的lipofactamine2000脂质体30微升，混匀。室温放置五分钟。然后把溶有dna的opti-mem溶液与溶有脂质体的opti-mem溶液混合在一起，混匀，室温放置20分钟。从培养箱中取出细胞，每三孔重复转染一种dna质粒，即每孔细胞中加入已经混匀室温放置20分钟的dna脂质体混合液500微升，轻轻摇匀，置于细胞培养箱中进行培养。六小时后，每孔换新鲜的完全培养基2.5毫升，继续培养48小时，取上清液，用coatestfviii试剂盒(chromogenix)根据试剂盒操作说明书来测试不同细胞上清液中的fviii含量。结果如下：转染pmigr1-△bcl2^eee-bddfviii、pmigr1-bcl2^eee-bddfviii、pmigr1-bcl2^wt-bddfviii、pmigr1-△hbcl2^eee-fviii、pmigr1-hbcl2^eee-fviii、pmigr1-hbcl2^wt-fviii、pmigr1-△gfp-bddfviii、pmigr1-△gfp-fviii的细胞上清液中的fviii含量分别为85.31±28.65mu/ml、37.57±8.59mu/ml、29.98±6.32mu/ml、13.93±3.22mu/ml、5.48±1.26mu/ml、3.80±0.84mu/ml、2.11±0.57mu/ml、0.84±0.28mu/ml。从结果可知，经过了第568位(人bcl2为第577位)核苷酸g突变成t，使对应于第190位(人bcl2相应为193位密码子)的甘氨酸残基密码子gga换成终止密码子tga后，与目的基因bddfviii或fviii在一个mrna链共表达后，不管是小鼠△bcl2^eee还是人△hbcl2^eee均能显著促进该目的基因的表达(pmigr1-△bcl2^eee-bddfviii与pmigr1-bcl2^eee-bddfviii、pmigr1-bcl2^wt-bddfviii和pmigr1-△gfp-bddfviii相比，p<0.05；pmigr1-△hbcl2^eee-fviii与pmigr1-hbcl2^eee-fviii、pmigr1-hbcl2^wt-fviii和pmigr1-△gfp-fviii相比，p<0.01)。

上述实施例并非是对于本发明的限制，本发明并非仅限于上述实施例，只要符合本发明要求，均属于本发明的保护范围。

序列表

1、第568位碱基g突变为t的小鼠bcl2突变体序列，如siqidno.1：

atggcgcaagccgggagaacagggtatgataaccgggagatcgtgatgaagtacatacattataagctgtcacagaggggctacgagtgggatgctggagatgcggacgcggcgcccctgggggctgcccccacccctggcatcttctccttccagcctgagagcaacccaatgcccgctgtgcaccgggacatggctgccaggacgtctcctctcaggcccctcgttgccaccgctgggcctgcgctcagccctgtgccacctgtggtccatctgaccctccgccgggctggggatgacttctctcgtcgctaccgtcgtgacttcgcagagatgtccagtcagctgcacctgacgcccttcaccgcgaggggacgctttgccacggtggtggaggaactcttcagggatggggtgaactgggggaggattgtggccttctttgagttcggtggggtcatgtgtgtggagagcgtcaacagggagatgtcacccctggtggacaacatcgccctgtggatgactgagtacctgaaccggcatctgcacacctggatccaggataactgaggctgggatgcctttgtggaactatatggccccagcatgcgacctctgtttgatttctcctggctgtctctgaagaccctgctcagcctggccctggtcggggcctgcatcactctgggtgcatacctgggccacaagtga

2、第568位碱基g突变为t和第69、70、84位氨基酸残基突变为谷氨酸残基的小鼠bcl2突变体序列，如siqidno.2：

atggcgcaagccgggagaacagggtatgataaccgggagatcgtgatgaagtacatacattataagctgtcacagaggggctacgagtgggatgctggagatgcggacgcggcgcccctgggggctgcccccacccctggcatcttctccttccagcctgagagcaacccaatgcccgctgtgcaccgggacatggctgccagggaggaacctctcaggcccctcgttgccaccgctgggcctgcgctcgaacctgtgccacctgtggtccatctgaccctccgccgggctggggatgacttctctcgtcgctaccgtcgtgacttcgcagagatgtccagtcagctgcacctgacgcccttcaccgcgaggggacgctttgccacggtggtggaggaactcttcagggatggggtgaactgggggaggattgtggccttctttgagttcggtggggtcatgtgtgtggagagcgtcaacagggagatgtcacccctggtggacaacatcgccctgtggatgactgagtacctgaaccggcatctgcacacctggatccaggataactgaggctgggatgcctttgtggaactatatggccccagcatgcgacctctgtttgatttctcctggctgtctctgaagaccctgctcagcctggccctggtcggggcctgcatcactctgggtgcatacctgggccacaagtga

3、第577位碱基g突变为t的人bcl2突变体序列，如siqidno.3：

atggcgcacgctgggagaacagggtacgataaccgggagatagtgatgaagtacatccattataagctgtcgcagaggggctacgagtgggatgcgggagatgtgggcgccgcgcccccgggggccgcccccgcaccgggcatcttctcctcccagcccgggcacacgccccatccagccgcatcccgggacccggtcgccaggacctcgccgctgcagaccccggctgcccccggcgccgccgcggggcctgcgctcagcccggtgccacctgtggtccacctgaccctccgccaggccggcgacgacttctcccgccgctaccgccgcgacttcgccgagatgtccagccagctgcacctgacgcccttcaccgcgcggggacgctttgccacggtggtggaggagctcttcagggacggggtgaactgggggaggattgtggccttctttgagttcggtggggtcatgtgtgtggagagcgtcaaccgggagatgtcgcccctggtggacaacatcgccctgtggatgactgagtacctgaaccggcacctgcacacctggatccaggataactgaggctgggatgcctttgtggaactgtacggccccagcatgcggcctctgtttgatttctcctggctgtctctgaagactctgctcagtttggccctggtgggagcttgcatcaccctgggtgcctatctgggccacaagtga

4、第577位碱基g突变为t和第69、70、87位氨基酸残基突变为谷氨酸残基的人bcl2突变体序列，如siqidno.4：

atggcgcacgctgggagaacagggtacgataaccgggagatagtgatgaagtacatccattataagctgtcgcagaggggctacgagtgggatgcgggagatgtgggcgccgcgcccccgggggccgcccccgcaccgggcatcttctcctcccagcccgggcacacgccccatccagccgcatcccgggacccggtcgccagggaggaaccgctgcagaccccggctgcccccggcgccgccgcggggcctgcgctcgaaccggtgccacctgtggtccacctgaccctccgccaggccggcgacgacttctcccgccgctaccgccgcgacttcgccgagatgtccagccagctgcacctgacgcccttcaccgcgcggggacgctttgccacggtggtggaggagctcttcagggacggggtgaactgggggaggattgtggccttctttgagttcggtggggtcatgtgtgtggagagcgtcaaccgggagatgtcgcccctggtggacaacatcgccctgtggatgactgagtacctgaaccggcacctgcacacctggatccaggataactgaggctgggatgcctttgtggaactgtacggccccagcatgcggcctctgtttgatttctcctggctgtctctgaagactctgctcagtttggccctggtgggagcttgcatcaccctgggtgcctatctgggccacaagtga

序列表

<110>杭州电子科技大学

<120>能促进较大基因表达的bcl2突变体及应用

<130>1

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>711

<212>dna

<213>人工序列(unknown)

<400>1

atggcgcaagccgggagaacagggtatgataaccgggagatcgtgatgaagtacatacat60

tataagctgtcacagaggggctacgagtgggatgctggagatgcggacgcggcgcccctg120

ggggctgcccccacccctggcatcttctccttccagcctgagagcaacccaatgcccgct180

gtgcaccgggacatggctgccaggacgtctcctctcaggcccctcgttgccaccgctggg240

cctgcgctcagccctgtgccacctgtggtccatctgaccctccgccgggctggggatgac300

ttctctcgtcgctaccgtcgtgacttcgcagagatgtccagtcagctgcacctgacgccc360

ttcaccgcgaggggacgctttgccacggtggtggaggaactcttcagggatggggtgaac420

tgggggaggattgtggccttctttgagttcggtggggtcatgtgtgtggagagcgtcaac480

agggagatgtcacccctggtggacaacatcgccctgtggatgactgagtacctgaaccgg540

catctgcacacctggatccaggataactgaggctgggatgcctttgtggaactatatggc600

cccagcatgcgacctctgtttgatttctcctggctgtctctgaagaccctgctcagcctg660

gccctggtcggggcctgcatcactctgggtgcatacctgggccacaagtga711

<210>2

<211>711

<212>dna

<213>人工序列(unknown)

<400>2

atggcgcaagccgggagaacagggtatgataaccgggagatcgtgatgaagtacatacat60

tataagctgtcacagaggggctacgagtgggatgctggagatgcggacgcggcgcccctg120

ggggctgcccccacccctggcatcttctccttccagcctgagagcaacccaatgcccgct180

gtgcaccgggacatggctgccagggaggaacctctcaggcccctcgttgccaccgctggg240

cctgcgctcgaacctgtgccacctgtggtccatctgaccctccgccgggctggggatgac300

ttctctcgtcgctaccgtcgtgacttcgcagagatgtccagtcagctgcacctgacgccc360

ttcaccgcgaggggacgctttgccacggtggtggaggaactcttcagggatggggtgaac420

tgggggaggattgtggccttctttgagttcggtggggtcatgtgtgtggagagcgtcaac480

agggagatgtcacccctggtggacaacatcgccctgtggatgactgagtacctgaaccgg540

catctgcacacctggatccaggataactgaggctgggatgcctttgtggaactatatggc600

cccagcatgcgacctctgtttgatttctcctggctgtctctgaagaccctgctcagcctg660

gccctggtcggggcctgcatcactctgggtgcatacctgggccacaagtga711

<210>3

<211>720

<212>dna

<213>人工序列(unknown)

<400>3

atggcgcacgctgggagaacagggtacgataaccgggagatagtgatgaagtacatccat60

tataagctgtcgcagaggggctacgagtgggatgcgggagatgtgggcgccgcgcccccg120

ggggccgcccccgcaccgggcatcttctcctcccagcccgggcacacgccccatccagcc180

gcatcccgggacccggtcgccaggacctcgccgctgcagaccccggctgcccccggcgcc240

gccgcggggcctgcgctcagcccggtgccacctgtggtccacctgaccctccgccaggcc300

ggcgacgacttctcccgccgctaccgccgcgacttcgccgagatgtccagccagctgcac360

ctgacgcccttcaccgcgcggggacgctttgccacggtggtggaggagctcttcagggac420

ggggtgaactgggggaggattgtggccttctttgagttcggtggggtcatgtgtgtggag480

agcgtcaaccgggagatgtcgcccctggtggacaacatcgccctgtggatgactgagtac540

ctgaaccggcacctgcacacctggatccaggataactgaggctgggatgcctttgtggaa600

ctgtacggccccagcatgcggcctctgtttgatttctcctggctgtctctgaagactctg660

ctcagtttggccctggtgggagcttgcatcaccctgggtgcctatctgggccacaagtga720

<210>4

<211>720

<212>dna

<213>人工序列(unknown)

<400>4

atggcgcacgctgggagaacagggtacgataaccgggagatagtgatgaagtacatccat60

tataagctgtcgcagaggggctacgagtgggatgcgggagatgtgggcgccgcgcccccg120

ggggccgcccccgcaccgggcatcttctcctcccagcccgggcacacgccccatccagcc180

gcatcccgggacccggtcgccagggaggaaccgctgcagaccccggctgcccccggcgcc240

gccgcggggcctgcgctcgaaccggtgccacctgtggtccacctgaccctccgccaggcc300

ggcgacgacttctcccgccgctaccgccgcgacttcgccgagatgtccagccagctgcac360

ctgacgcccttcaccgcgcggggacgctttgccacggtggtggaggagctcttcagggac420

ggggtgaactgggggaggattgtggccttctttgagttcggtggggtcatgtgtgtggag480

agcgtcaaccgggagatgtcgcccctggtggacaacatcgccctgtggatgactgagtac540

ctgaaccggcacctgcacacctggatccaggataactgaggctgggatgcctttgtggaa600

ctgtacggccccagcatgcggcctctgtttgatttctcctggctgtctctgaagactctg660

ctcagtttggccctggtgggagcttgcatcaccctgggtgcctatctgggccacaagtga720