本发明涉及细胞培养
技术领域：
，具体涉及一种细胞培养基及其应用，更具体涉及一种成纤维细胞培养基及其培养方法及由此方法获得成纤维细胞。
背景技术：
：成纤维细胞，也称为纤维母细胞，是疏松结缔组织的主要细胞成分，属于终末分化细胞，这种细胞会制造胶原蛋白等蛋白质。成纤维细胞数目最多，胞体大，为多突的纺锤形或星形的扁平细胞，细胞核呈规则的卵圆形，细胞轮廓不清，具有突起。其形态尚可依细胞的功能变化及其附着处的物理性状不同而发生改变。成纤维细胞胞体较大，胞质弱嗜碱性，胞核较大呈椭圆形，染色质疏松着色浅，核仁明显。电镜下，其胞质可见丰富的粗面内质网、游离核糖体和发达的高尔基复合体，表明它具有合成和分泌蛋白质的功能。成纤维细胞尚可合成和分泌胶原纤维、弹性纤维、网状纤维及有机基质。它合成的前胶原蛋白分子经内切酶作用，聚合和重排，可形成与成骨细胞合成分泌的胶原原纤维一样具有64nm周期横纹的胶原原纤维，胶原原纤维经互相粘合形成胶原纤维。经检测，这两种细胞合成分泌的胶原纤维均是ⅰ型胶原纤维，在形态和生化结构上完全相同。处于成熟期或称静止状态的纤维细胞，胞体变小，呈长梭形，粗面内质网和高尔基复合体均不发达，被称为纤维细胞。在外伤等因素刺激下，部分纤维细胞可重新转变为幼稚的成纤维细胞，其功能活动也得以恢复，参与组织损伤后的修复。另外，在结缔组织中，仍保留着少量具有分化潜能的间充质细胞，它们在创伤修复等情况下可增殖分化为成纤维细胞。laviv自体成纤维细胞注射是美国fibrocell公司开发的自体成纤维细胞移植美容技术，2011年6月22日获美国食品药品管理局(fda)批准用于改善成人中重度鼻唇沟皱纹。laviv是一种个体化美学细胞疗法，其专利技术是提取患者本人生成胶原的皮肤细胞--成纤维细胞并进行增殖。laviv需要连续注射3次，相邻2次治疗的间隔时间为3～6周。其治疗流程大致为：(1)、从患者耳后取约3～4平方毫米的皮肤，分离出真皮内的成纤维细胞，送至厂商工厂(fibrocellcgmp)；(2)、在工厂内，将样本纤维原细胞培养增殖大量新细胞，冷冻储藏，供多次注射治疗使用；(3)、治疗时，将培养增殖细胞注射入患者自体皮肤，从而达到增加局部纤维原细胞数量、促进胶原形成、促进自身再生修复过程的功效。优势：自体细胞和患者组织相容，成功解决了排斥问题，该细胞可以存活于体内，在注射后即刻及较长时间段内都具有对皱纹或皮肤凹陷的治疗效果。没有证据表明细胞在注射后会被机体吸收或损失，随着时间的推移，除皱的效果更加显著。laviv自体成纤维细胞注射技术自1995年开始，已经在英国开展6000多个临床病例，美国开展2000多个临床病例，最长随访病例长达6年。患者满意度高，除注射部位不良反应外，未出现严重不良反应。不良反应：在临床试验中，最常见的不良反应是注射部位发红、瘀伤、肿胀、疼痛、出血、水肿、结节、丘疹、刺激、皮炎和瘙痒。注射部位反应在严重程度上多数属轻度至中度，并在1周内消退。技术实现要素：为解决当前人体成纤维细胞在美容抗衰领域中存在的laviv细胞回输见效慢，时间成本和经济成本高，现提供一种细胞培养基及其应用、及成纤维细胞培养方法，不仅提高了成纤维细胞的活性，促进成纤维细胞分泌胶原蛋白，而且缩短了成纤维细胞抗衰除皱时间，对于迫切需求改善的治疗者缩短了等待时间，降低了治疗的经济成本和时间成本。为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：本发明提供一种细胞培养基，该培养基包括以下培养基成分：生长培养基和干细胞培养基的培养上清。其中上述生长培养基为：以高葡萄糖dmem为基础培养基，添加0.5-15％(v/v)胎牛血清和0.05-1％浓度为1％的抗生素。其中所述的抗生素为细胞培养领域常规用抗生素，如链霉素、青霉素、庆大霉素等。其中上述的干细胞培养基的培养上清是指干细胞在培养过程中使用的培养基，在干细胞培养过程中干细胞换液或者传代中而吸取丢弃的已培养干细胞的培养液。将上述吸取丢弃的已培养干细胞的培养液经离心处理后即为本申请中所述的干细胞培养基的培养上清。其中上述细胞培养基中生长培养基和干细胞培养基的培养上清比例为0.1-100:0.1-30。更进一步的，上述细胞培养基中生长培养基和干细胞培养基的培养上清比例为0.1-50:0.1-10。更进一步的，上述细胞培养基中生长培养基和干细胞培养基的培养上清比例为1-20:5-10。其中上述的干细胞可以为按功能划分的全能干细胞、多能干细胞、多潜能干细胞或者专一性干细胞；也可以是按发育过程出现先后和分步分类的各种干细胞，如胚胎干细胞、成体干细胞等。其中上述的干细胞，优选为脐带间充质干细胞(ucmsc)。本申请的另一个目的在于提供上述细胞培养基的应用，该细胞培养基应用于培养动物细胞，特别是人体成纤维细胞。本申请的第三个目的在于提供一种成纤维细胞(laviv)的培养方法，该培养方法包括以下步骤:a、按照医学或本领域常规方法获得成纤维细胞；b、使用上述的细胞培养基培养至细胞汇合度达80％-90％；c、每次传代皆用上述细胞培养基。本申请的第四个目的在于提供一种成纤维细胞(laviv)及其应用，由上述细胞培养基培养获得的成纤维细胞，其活性高、分泌胶原蛋白量高，其更适用于在美容抗衰领域中的应用。本发明的有益效果是：本发明提供培养基营养成分简单、配置方便，而且应用于培养成纤维细胞，不但提高成纤维细胞的活性，促进成纤维细胞分泌胶原蛋白，而且成纤维细胞应用人体后缩短了成纤维细胞抗衰除皱时间，对于迫切需求改善的治疗者缩短了等待时间，降低了治疗的经济成本和时间成本；而且本发明所使用的培养基成分简单配制简便，充分利用废弃资源，合理化开发废物再利用，变废为宝，节约成本。具体实施方式为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。实施例1获得干细胞培养基的培养上清1.复苏脐带间充质干细胞至t-175培养瓶1.1按照dmem：fbs：浓度为1％抗生素＝100:10:1配置细胞生长培养基，分别量取500mldmem、50mlfbs、5ml1％的抗生素，其中所述的抗生素为细胞培养中常规使用抗生素；1.2从液氮储存箱中取出脐带间充质干细胞的冻存管置于37℃恒温水浴锅解冻复苏；1.3解冻至有微小冰晶状态时迅速转至生物安全柜内；1.4将冻存管内液体吸入15ml离心管，并加入10mlpbs混匀后吸取200ul计数，其余离心，离心条件为400g，5min；1.5离心结束后弃上清，将细胞用1.1步骤配置的生长培养基转至t-175培养瓶中，并补加培养基至40ml；1.6将t-175培养瓶置于37℃，5％二氧化碳浓度培养箱进行培养。2.换液2.1显微镜下观察至脐带间充质干细胞汇合率至80％前每间隔一天进行一次换液；2.2从二氧化碳培养箱中取出t-175培养瓶置于生物安全柜中；2.3吸弃20ml原培养基；2.4加入20ml新鲜生长培养基；2.5摇匀后放回二氧化碳培养箱继续培养；2.6将上述2.3步骤中吸弃的原培养基离心后即为干细胞培养基的培养上清(ucmsc上清)，保存至-20℃以备后用。3.传代3.1显微镜下观察，脐带间充质干细胞汇合率达到80％进行传代；3.2从二氧化碳培养箱中取出t-175培养瓶置于生物安全柜中；3.3吸弃t-175培养瓶中培养基并离心获得干细胞培养上清，后用10mlpbs洗涤培养瓶面；3.4弃pbs，加入5ml胰酶消化2min30s；3.5显微镜下观察细胞变圆后，加入35ml生长培养基，终止消化；3.6混匀后吸取20ml培养基至一个新的t-175培养瓶中；3.7向2瓶t-175培养瓶中各加20ml生长培养基，混匀后置于二氧化碳培养箱继续培养；3.8将弃置并离心后的干细胞培养上清(ucmsc上清)保存至-20℃以备后用。4.换液4.1显微镜下观察至细胞汇合率至80％前每间隔一天进行一次换液；4.2从二氧化碳培养箱中取出两瓶t-175瓶置于生物安全柜中；4.3各吸弃20ml原培养基，并将吸弃的原培养基离心处理得干细胞培养上清；4.4分别加入20ml新鲜生长培养基；4.5摇匀后放回二氧化碳培养箱继续培养；4.6将获得的干细胞培养上清(ucmsc上清)保存至-20℃以备后用。实施例2纤维细胞培养1.复苏成纤维细胞至t-75培养瓶1.1按照dmem：fbs：浓度为1％抗生素＝100:10:1配置细胞生长培养基，分别量取500mldmem、50mlfbs、5ml1％的抗生素，其中所述的抗生素为细胞培养中常规使用抗生素；1.2从液氮储存箱中取出冻存的成纤维细胞冻存管置于37℃恒温水浴锅解冻复苏；1.3解冻至有微小冰晶状态时迅速转至生物安全柜内；1.4将冻存管内液体吸入15ml离心管，并加入10mlpbs混匀后吸取200ul计数，其余离心，离心参数：速度1000rpm、温度4℃、离心时间10min；1.5离心结束后，取出15ml离心管；1.6物理方法消毒离心管，转入生物安全柜；1.7移除离心管中上清液；1.8使用上述1.1步骤配置的生长培养基重悬细胞，以每瓶5×105细胞接种至4个t-75培养瓶中；1.9标记4个培养瓶分别为：0％ucmsc上清，25％ucmsc上清，50％ucmsc上清，75％ucmsc上清，并补加培养基:1.10将上述每组置于二氧化碳培养箱培养。2.换液2.1显微镜下观察成纤维细胞生长情况，在汇合率达到90％前每隔一天进行一次换液；2.2上下轻摇t-75培养瓶，每瓶均移除约6ml培养基；2.3补加培养基2.4轻摇t-75培养瓶，混匀培养基；2.5将培养瓶置于二氧化碳培养箱培养。3.传代3.1显微镜下观察细胞生长情况，汇合率达到90％后由4个t-75传到4个t-175；3.2上下轻摇t-75培养瓶，移除t-75培养瓶中全部培养基；3.3吸取10mlpbs至t-75培养瓶，轻摇培养瓶洗涤，洗涤时间2分钟；3.4移除上述洗涤液，吸取10mlpbs至t-75培养瓶，轻摇培养瓶洗涤，洗涤时间2分钟；3.5移除全部pbs；3.6吸取2ml胰蛋白酶溶液至上述t-75培养瓶；3.7轻摇t-75培养瓶，使胰蛋白酶溶液尽量浸润至所有培养瓶生长面；3.8放置37.0二氧化碳培养箱中消化4分钟；3.9显微镜下观察细胞，有80-90％细胞“聚集”变圆时，轻拍培养瓶壁，使成纤维细胞彻底脱落t-75培养瓶；3.10加入10ml生长培养基阻断消化；3.11将上述溶液转移至新的t-175瓶中；按照比例补加生长培养基和ucmsc上清至40ml；3.12轻摇t-175培养瓶，混匀培养基；3.13将培养瓶置于二氧化碳培养箱培养。4.换液4.1显微镜下观察成纤维细胞生长情况，在汇合率达到90％前每隔一天进行一次换液；4.2上下轻摇t-175培养瓶，移除约20ml培养基；4.3补加培养基4.4轻摇t-175培养瓶，混匀培养基；4.5将培养瓶置于二氧化碳培养箱培养。在上述每组成纤维细胞培养中，显微镜观察发现每组成纤维细胞生长状态在形态上差别不大，但是添加ucmsc上清培养的成纤维细胞生长速度较快，在0％ucmsc上清组中成纤维细胞生长汇合度达到60％时，添加ucmsc上清的实验组成纤维细胞生长汇合度可以达到80％以上，而且随着ucmsc上清添加量增加，其生长汇合度越早达到80％以上，成纤维细胞生长速度同ucmsc上清添加量呈现剂量依赖性关系。实施例3成纤维细胞培养液胶原蛋白检测1.取成纤维细胞培养过程中t-75换液弃置上清，t-75传t-175弃置上清，t-175弃置上清，并对各上清进行胶原蛋白检测1.1取4只centriconpl-70超滤装置，分别对应0％ucmsc上清组、25％ucmsc上清组、50％ucmsc上清组、75％ucmsc上清组进行标记取样；1.2向每一个过滤杯中，加入待浓缩样品，盖上杯盖；1.3离心4个过滤装置，离心参数设置：离心力3500xg、加速减速8、时间35分钟；1.4离心结束，取出过滤装置，移除滤液收集杯中的全部培养液，将过滤杯的杯盖放置一旁，颠倒过滤杯，并放回滞留物杯中；1.5将4个过滤装置放回离心机中，离心参数设置：离心力1000xg，加速减速8，时间2分钟；1.6离心结束，取出4个过滤装置；1.7从过滤装置中移出滞留物杯，各取1ml滤液进行胶原蛋白检测。2.检测胶原蛋白含量(单位：ug/ml)分组0％ucmsc上清25％ucmsc上清50％ucmsc上清75％ucmsc上清t-75换液1337.1011851.7941794.7491844.354t-75传t-1751560.8601942.5611911.5692026.013t-175换液1518.1142001.8571976.0341972.928实施例4成纤维细胞端粒检测实验方法：实时荧光定量pcr样本：本申请方法采用含有ucmsc上清培养获得的成纤维细胞、不含有ucmsc上清培养获得的成纤维细胞，如实施例2和实施例3中所述的实验组别。dna提取：按照本领域常规方法进行成纤维细胞的dna的提取。端粒检测：缓冲液teph8.0稀释基因组dna样品为35ng/ul，95℃5min，冰浴5min，730g短暂离心。pcr样品分为两部分，第一部分是检测样品端粒长度pcr扩增ct值第二部分是检测内参单拷贝基因pcr扩增ct值。同时每次反应都包含标准曲线。标准品和样品基因组dna做3个复孔，样品包含待检测基因组dna样品和对照组36b4基因组dna，pcr反应体系如下：2×sybrpremixextaq，rox基准染色，基因dna35ng，端粒长度扩增引物：tel1，90nm；tel2，300nm；对照基因36b4u和36b4d引物终浓度都为150nm。引物设计如下：tel1：ggtttttgagggtgagggtgagggtgagggtgagggt：tel2：tcccgactatccctatccctatccctatccctatcccta：36b4u：cagcaagtgggaaggtgtaatcc；36b4d：cccattctatcatcaacgggtacaa；端粒长度荧光实时定量pcr检测采用prism7000序列检测系统，pcr条件：95℃10s，95℃5s，54℃30s，72℃31s，40个循环，abip日说明7000sdssoftware采集分析数据，公示2-△ct决定端粒/单拷贝(t/s)比率，△ct＝cttelomere-ctβ2-globin，相对t/s比率＝2-(△ct1-△ct2)＝2-△△ct，△ct1-表示每个样品t/s比率，△ct2-表示参考dna的t/s比率。分组0％ucmsc上清25％ucmsc上清50％ucmsc上清75％ucmsc上清相对t/s比率1.061.682.064.44衰老的相关研究指出，随着生长时长增加端粒长度逐渐缩短，通过作用于细胞进而影响组织器官功能状况，端粒长度与年龄成反比，端粒缩短至终末复制障碍，将导致机体衰老及疾病发生。由上述测端粒长度可以看出通过本申请方法培养出的成纤维细胞其端粒长度长于不含有ucmsc上清培养的成纤维细胞，也即预示着本申请方法培养出的成纤维细胞衰老慢，维持机体生理功能更长久。实施例5临床抗衰、除皱在临床实验中心，选取6例预抗衰、除去面部皱纹的40-55岁女士，其中3人使用不添加ucmsc上清的培养方法获得的成纤维细胞，3人使用本申请添加ucmsc上清培养获得的成纤维细胞，连续注射3次，在面部相邻2次治疗的间隔时间为3周，注射部位为面部脸颊皱纹处及嘴角皱纹处。6个月内每月观察并记录6名女士的抗衰除皱效果。当前第1页12