一种柞蚕蛹虫草生物活性肽的制备方法与流程

本发明公开涉及活性肽制备的
技术领域：
，尤其涉及一种柞蚕蛹虫草生物活性肽的制备方法。
背景技术：
：蛹虫草，又名北冬虫夏草、北虫草，与冬虫夏草同属异种。研究表明蛹虫草具有与冬虫夏草极其相似的有效成分和药用功效，如益精气、补虚损、抑菌、降压、镇静、降糖、免疫调节等作用。同昂贵的野生冬虫夏草相比，人工栽培的蛹虫草成分体系豪不损失，特别在抗癌成分虫草素、喷司他丁含量上更显优势，此外，人工栽培的蛹虫草还含有虫草多糖、麦角甾醇、黄酮类、生物碱类、sod酶等生物活性物质，这为蛹虫草高端产品开发奠定了物质基础。生物活性肽是机体完成各种生理活动必不可少的重要物质，在生物的代谢活动和疾病治疗中起着不可替代的作用。目前，生物活性肽大多是由冬虫夏草制备而成，随着人工栽培蛹虫草技术的提升，是否可将人工栽培蛹虫草作为原料进行生物活性肽的制备，成为人们研究的对象。技术实现要素：鉴于此，本发明公开提供了一种柞蚕蛹虫草生物活性肽的制备方法，以实现以人工栽培的蛹虫草作为原料，制备获得高活性的生物活性肽。本发明提供的技术方案，具体为，一种柞蚕蛹虫草生物活性肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：1)以活体柞蚕蛹作为培养基，接种功能性蛹虫草“素高1号”液体菌种，经常规培养得子座完整的柞蚕蛹虫草；2)将步骤1)中的柞蚕蛹虫草子座进行冷冻干燥后，粉碎，得干粉；3)取步骤2)中的干粉，加去离子水后，加入碱性蛋白酶和胰蛋白酶两种蛋白酶进行酶解，得酶解液；4)将步骤3)中的酶解液经粗过滤以及离心去除固态渣子，留上清液；5)取步骤4)中的上清液依次注入分子量10万道尔顿的超滤柱、分子量1万道尔顿的超滤柱以及分子量1000道尔顿的超滤柱过滤，得小分子生物活性肽类混合液；6)在无菌条件下，将步骤5)中的小分子生物活性肽类混合液，采用细菌过滤器进行除菌，得成品。优选，在步骤6)之后将所述成品放入真空冷冻干燥机中，制备成肽类冷冻干燥粉。进一步优选，步骤1)中以活体柞蚕蛹作为培养基，接种功能性蛹虫草“素高1号”液体菌种后，在温度为15℃～20℃、湿度为70％～90％条件下，培养55天～60天，培养得子座完整的柞蚕蛹虫草。进一步优选，步骤2)中所述冷冻干燥的环境为：温度为-25℃，真空度为10-12pa,高压均质压力为1.2×105kpa。进一步优选，步骤2)中粉碎得干粉的温度为-10℃至-20℃，干粉的细度为120目。进一步优选，按重量计，步骤3)中蛋白酶的加入量为干粉的6％，其中，碱性蛋白酶和胰蛋白酶的加入量为1:1，且先加入碱性蛋白酶后，再加入胰蛋白酶。进一步优选，碱性蛋白酶和胰蛋白酶的酶解温度均为55℃，按规定顺序酶解时间均为2h，底物浓度为10％。进一步优选，所述碱性蛋白酶为食品级20万u，所述胰蛋白酶为食品级10万u。进一步优选，步骤6)中采用的细菌过滤器为0.22微米的细菌过滤器。本发明提供的柞蚕蛹虫草生物活性肽的制备方法，该方法首次采用最为接近天然冬虫夏草的柞蚕蛹虫草为原料，以保证制得小分子生物活性肽的丰富度、含量和抗氧化活性；同时配合采用双蛋白酶联合酶解法，使酶解更彻底，小分子肽比例提高，活性更强；而且双蛋白酶联合酶解法中采用的为碱性蛋白酶和胰蛋白酶，大大降低了活性肽的制备方法；整个活性肽的制备全程是在55℃以下，没有高温环节，因此，制得的活性肽抗氧化能力和清除超氧自由基的能力强，具有易溶解、耐酸、耐热、稳定性高的优点；此外，制备获得的活性肽经高效液相色谱法分离后，图谱清晰、物质分离度高、分散度好，达到优质水平。本发明提供的柞蚕蛹虫草生物活性肽的制备方法，具有制备方法简单、易于操作等优点，制得的生物活性肽中小分子肽比例高，活性强等优点。应当理解的是，以上的一般描述和后文的细节描述仅是示例性和解释性的，并不能限制本发明的公开。附图说明此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本发明的实施例，并与说明书一起用于解释本发明的原理。为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1为实施例1中制作的蛋白质标准曲线；图2为实施例2中胰蛋白酶酶解时随时间因素的变化曲线；图3为实施例2中胰蛋白酶酶解时随加酶量因素的变化曲线；图4为实施例2中胰蛋白酶酶解时随底物浓度因素的变化曲线；图5为实施例2中碱性蛋白酶酶解时随时间因素的变化曲线；图6为实施例2中碱性蛋白酶酶解时随加酶量因素的变化曲线；图7为实施例2中碱性蛋白酶酶解时随底物浓度因素的变化曲线。具体实施方式下面以具体的实施方案对本发明进行进一步的解释说明，但是并不用于限制本发明的保护范围。实施例1：1、蛋白质标准曲线的制作(1)准确称量100mg牛血清白蛋白(bsa)，定容，配制10mg/ml的蛋白质标准溶液。(2)准确称量1.5g五水硫酸铜和6g酒石酸钾钠，加入500ml去离子水，搅拌后加入300ml10％的氢氧化钠溶液，最后用去离子水定容至1000ml，即双缩脲试剂(可长期保存)。(3)按下表将不同毫升的蒸馏水和牛血清白蛋白溶液加入各个试管中，加入4ml双缩脲试剂混匀后，室温下放置30min。以1ml去离子水为空白对照，在波长540nm处测定吸光值。重复3次，取平均值，以蛋白质浓度为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线，具体见图1。no.123456bsa00.20.40.60.81.0蒸馏水1.00.80.60.40.20双缩脲试剂4.04.04.04.04.04.02、待测样品中多肽含量的测定取1ml待测样品，加入4ml双缩脲试剂混匀，室温下放置30min。在波长540nm处测定吸光值，代入标准曲线中计算待测样品浓度(mg/ml)。3、待测样品酶解度的测定采用tca-sn％法，取4.5ml酶解液与4.5ml10％tca溶液混合反应30min，4000r/min离心10min，取上清液1ml加入4ml双缩脲试剂，室温下放置30min，反应结束后，在540nm波长下测定吸光值，并根据下面的公式计算出蛹虫草酶解液的多肽指数。公式中：tca-sn％蛹虫草酶解液的多肽指数；c蛋白质浓度(mg/ml)；v上清液体积(ml)；w蛹虫草的质量(mg)。实施例2：单酶酶解实验1、单酶筛选准确称量0.5g蛹虫草粉于试管中并放入4.5ml去离子水(即底物浓度为10％)，蛹虫草粉和去离子水混合均匀后调节ph值至各蛋白酶的最适ph值，分别加入3％碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶。将水浴锅调至各蛋白酶最适温度，幵始酶解，时间为2、4、6、8、10h，酶解时间结束后，煮沸10min使蛋白酶灭活，冷却后加入等体积的10％tca溶液，室温下静置30min，4000r/min离心10min后取1ml上清液加4ml双缩脲试剂，每组重复3次，测a540。最后代入公式计算出多肽指数最高的蛋白酶，结果如下，碱性蛋白酶和胰蛋白酶酶解效果最好。序号蛋白酶多肽指数(％)酶a碱性蛋白酶147.1酶b胰蛋白酶122.3酶c木瓜蛋白酶100.12、单因素实验根据单酶筛选结果，选取酶解效果最好的两种蛋白酶(酶a和酶b)，从底物浓度、加酶量、酶解时间三个因素进行考察，分别确定上述因素对酶a和酶b酶解柞蚕蛹虫草程度的影响，实验设计如表。no.酶解时间(h)底物浓度(％)加酶量(％)127324843695481065101173、胰蛋白酶的单因素实验结果柞蚕蛹虫草使用胰蛋白酶酶解进行单因素实验，如图2～图4所示，最佳的酶解效果为：酶解时间4h，加酶量6％，底物浓度8％。4、碱性蛋白酶的单因素实验结果柞蚕蛹虫草使用碱性蛋白酶酶解进行单因素实验，如图5～图7所示，最佳的酶解效果为：酶解时间4h，加酶量6％，底物浓度8％。5、胰蛋白酶酶解柞蚕蛹虫草的正交实验胰蛋白酶酶解柞蚕蛹虫草的正交实验的分析结果见下表。胰蛋白酶酶解柞蚕蛹虫草的最佳酶解组合为a2b2c3，即酶解时间为4h，加酶量为6％，底物浓度为9％，此条件下多肽的提取率最高。6、碱性蛋白酶酶解柞蚕蛹虫草的正交实验碱性蛋白酶酶解柞蚕蛹虫草的正交实验的分析结果见表。碱性蛋白酶酶解柞蚕蛹虫草的最佳酶解组合为a2b2c3，即酶解时间为4h，加酶量为6％，底物浓度为9％，此条件下多肽的提取率最高。实施例3：双酶酶解实验1、柞蚕蛹虫草双酶酶解组合的实验使用酶a和酶b进行双酶酶解，酶解条件是底物浓度9％，加酶量4％，酶解时间4h，酶a和酶b的组合方式按照下表，根据可溶性氮含量确定酶a和酶b的最佳组合方式。no.酶a酶b酶量比1先加后加1：12后加先加1：13同时加同时加1：1柞蚕蛹虫草双酶酶解组合的实验结果如下表。由表可知柞蚕蛹虫草双酶酶时，双酶的最佳组合方式是先加碱性蛋白酶后加胰蛋白酶。组合方式可溶性氮含量(mg/ml)先加碱性蛋白酶后加胰蛋白酶12.131先加胰蛋白酶后加碱性蛋白酶11.970同时加碱性蛋白酶和胰蛋白酶11.6672、双酶酶解正交实验根据单因素实验结果，通过正交实验确定提取蛹虫草多肽的底物浓度、加酶量和酶解时间最佳组合方式，按照三因素三水平正交表进行组合实验。实验结果如表，柞蚕蛹虫草双酶酶解的最佳酶解组合为a4b1c4d2，即温度为55℃，酶解时间为2h，加酶量为6％，底物浓度为10％，此条件下多肽的提取率最高3、柞蚕蛹虫草单酶酶解与双酶酶解的实验结果对比柞蚕蛹虫草单酶、双酶酶解的实验结果对比如表。由表可知柞蚕蛹虫草使用双酶酶解的方法获得的可溶性氮含量比使用碱性蛋白酶或胰蛋白酶进行单酶酶解多。实施例4：制备柞蚕蛹虫草生物活性肽柞蚕蛹虫草生物活性肽制备的步骤具体如下：1)选用活体柞蚕蛹作为培养基，接种功能性蛹虫草“素高1号”液体菌种，在温度为15℃～20℃、湿度为70％～90％条件下，培养55天～60天，得子座完整的柞蚕蛹虫草；2)对柞蚕蛹虫草子座进行低温冷冻干燥，温度控制在-25℃，真空度为10-12pa,高压均质压力为1.2×105kpa，该工艺充分保证了原料本身活性物质补损耗、活性不降低，将柞蚕蛹虫草原料干品，利用超微粉碎机进行低温粉碎，料温-10℃至-20℃、粉碎细度120目，得干粉；3)在上述干粉中加去离子水后，在加入碱性蛋白酶和胰蛋白酶两种蛋白酶进行酶解，得酶解液，其中，碱性蛋白酶和胰蛋白酶均选用食品级的作为肽类生产酶制剂，这有利于降低大规模生产的成本，具体而言，碱性蛋白酶选用食品级20万u，胰蛋白酶选用食品级10万u，上述两种蛋白酶的加入量为干粉的6％，且碱性蛋白酶和胰蛋白酶的加入量为1:1，优选，先加入碱性蛋白酶后，再加入胰蛋白酶，酶解温度55℃，酶解时间各2h，底物浓度10％，经检测可溶性氮含量达到16.51mg/ml。此外，该混合肽液中还含有虫草素，浓度1.53mg/ml；腺苷，含量0.78mg/ml；多糖，12.4％；它们的存在和含量提升了本肽类产品的保健效果和市场价值；其中，采用tca-sn％法测定酶解后肽的含量；使用铁氰化钾还原法测定柞蚕蛹虫草小分子生物活性肽的还原能力；使用水杨酸法测定其对羟基自由基清除能力；使用邻苯三酚自氧化法测定其清除超氧阴离子自由基能力；4)上述酶解液酶解液经冷却，粗过滤及离心去除固态渣子，留上清液；5)取上清液注入分子量10万道尔顿的超滤柱进行过滤，获得10万道尔顿以下分子量的肽类混合液，混合液呈紫红色，清澈透明；然后将肽类混合液再注入分子量10000道尔顿的超滤柱过滤，获得分子量小于1万道尔顿的肽类混合液，滤出液呈淡黄色，清澈透明；最后将肽类混合液再注入分子量1000道尔顿的超滤柱过滤，获得分子量小于1000道尔顿的肽类混合液，滤出液呈淡黄色，清澈透明；6)在无菌条件下，采用0.22微米的细菌过滤器对小分子肽滤液进行除菌处理，然后将无菌混合肽液分装到无菌三角瓶容器中，-86℃低温保存；7)将冷冻的小分子混合肽液，放入真空冷冻干燥机中，制备成肽类冻干粉，用安瓿瓶长期低温保存。上述制备的活性肽可用于口服液和化妆品的原料。其中，上述制备方法步骤1)中所述“素高1号”液体菌种为备案编号为：辽备菌2015005菌种。该实施例以柞蚕为基质培育的蛹虫草称为柞蚕蛹虫草，其培育工艺和成分与野生冬虫夏草最为接近，特别在肽类物质种类和含量上，二者相似度更高。柞蚕蛹虫草有效成分含量是普通蛹虫草的2～3倍，小分子肽、虫草素、sod酶含量分别是普通蛹虫草的2.6倍、6倍、3.2倍，锌、铁、硒、锗、钙等微量元素更是高于普通虫草。这些有效成分在蛹虫草小分子生物活性肽制备中会被保留下来，构成虫草肽类产品中重要活性物质，发挥机体调理、抗菌消炎，抗氧化，延缓衰老、消除褐斑、提高皮肤活力的保健功效。实施例5：对实施例4中的蚕蛹虫草生物活性肽进行性能测试1、柞蚕蛹虫草多肽还原能力的测定使用铁氰化钾还原法。取1ml各浓度待测液(空白为1ml蒸馏水)，加入质量分数为1％的铁氰化钾溶液2.5ml和2.5ml，ph＝6.6的0.2mol/l的磷酸缓冲溶液混合均匀，放置在50℃处20min，再加入质量分数为10％的三氯乙酸溶液2.5ml，3000r/min离心10min，取上清液2.5ml，加2.5ml蒸馏水和0.5ml质量分数为10％的三氯乙酸。混匀后在700nm处测吸光值a700，重复3次，求平均值。a700值为1.190。2、柞蚕蛹虫草多肽对羟基自由基清除能力的测定使用水杨酸法。取1.0ml待测液于试管中，分别加入0.2mlh2o2溶液，0.2mlfeso4溶液，0.2ml水杨酸-乙醇溶液，3.4ml蒸馏水，混合均匀后在37℃条件下反应30min。在510nm处测定吸光值a510。试验空白为蒸馏水，对照管为不加待测液的反应液。可得柞蚕蛹虫草多肽对羟基自由基清除能力为49.58％。3、柞蚕蛹虫草多肽对超氧阴离子自由基清除能力的测定使用邻苯三酚自氧化法。在试管中，加入ph＝8.2的50mmol/l的tris-hcl缓冲液4.5ml，1ml待测液，在25℃水浴锅中保温20min，加入同样预温的25mmol/l的邻苯三酚300μl，混匀后，在25℃水浴锅中反应4min，加0.5ml浓盐酸终止反应，测420nm处的吸光值。计算得柞蚕蛹虫草多肽对超氧阴离子自由基清除能力为55.14％。4、柞蚕蛹虫草多肽对dpph自由基清除能力的测定使用dpph法。取1.0ml待测液于试管中，分别加入1.5mldpph溶液、1.5ml蒸馏水，混合均匀后在25℃条件下反应30min,反应结束后在517nm处测吸光值。实验空白为加1.5ml无水乙醇、1.5ml蒸馏水的反应液。对照管为加1.5mldpph溶液、1.5ml蒸馏水的反应液。与对照组的a517比较，测定待测液对dpph的清除作用为67.05％。本领域技术人员在考虑说明书及实践这里公开的发明后，将容易想到本发明的其它实施方案。本申请旨在涵盖本发明的任何变型、用途或者适应性变化，这些变型、用途或者适应性变化遵循本发明的一般性原理并包括本发明未公开的本
技术领域：
中的公知常识或惯用技术手段。说明书和实施例仅被视为示例性的，本发明的真正范围和精神由下面的权利要求指出。应当理解的是，本发明并不局限于上面已经描述并在附图中示出的精确结构，并且可以在不脱离其范围进行各种修改和改变。本发明的范围仅由所附的权利要求来限制。当前第1页12