【技术领域】
本发明属于生物质资源高效利用技术领域，特别涉及一种水热预处理与高温混合酶协同降解植物生物质的方法。
背景技术：
利用新型工业模式将植物生物质原料转化为高附加值的生物能源、材料及大宗化学品，已成为许多国家的重要发展战略和科学研究的热点领域。要将低值化的植物生物质原料变成制备高值化产品的原料，首先需要构建高浓度的“糖平台”。因此，突破抗生物和酶攻击的天然屏障成为实现植物生物质原料技术经济性合理的前提与关键。
预处理技术可以打破植物生物质原料的致密结构，增大其表面孔径和表面积，从而提高原料的纤维素酶解率及后续微生物的多糖利用率。在众多预处理法中，高温水热预处理因无需添加任何化学试剂，环保高效，可去除大量半纤维素和部分木质素，同时副产物含量低等优点，被认为是一种低成本绿色预处理方法。然而，水热预处理主要水解半纤维素，对于原料中的木质素降解效果甚微。而木质素是制约植物生物质原料后续酶解糖平台构建的关键因素。因此，多种预处理方法的组合处理是得到高浓度糖平台的主要方法。植物生物质原料的生物预处理利用微生物及其分泌的酶来达到降解生物质的目的。它是一种低成本、低能耗，环境友好的成本及能耗较低的预处理方法。将物理化学预处理方法与生物预处理方法协同作用将有助于实现植物生物质原料的高效解聚。然而，目前植物生物质降解菌株多以常温菌株褐腐菌和白腐菌为主，存在种类稀缺、周期较长以及糖分损耗较大等问题。且所分泌的酶制剂的耐热性较差。嗜热毁丝霉(myceliophthorathermophile)是一种可产生具有高热稳定性纤维素分解酶的嗜热真菌，同时还是漆酶的工业生产菌。它分泌的这些酶制剂具有很高的热稳定性。本发明的目的在于提供一种以嗜热毁丝霉分泌酶制剂协同水热预处理高温降解植物生物质的方法。
技术实现要素：
【发明目的】
针对水热预处理对于植物生物质原料中木质素降解效果甚微，微生物预处理存在菌种种类稀缺、处理周期较长以及糖分损耗较大等问题，本发明的目的是，提供一种水热预处理与高温混合酶协同高效降解植物生物质原料的方法。
【技术方案】
本发明提供了一种水热预处理与高温混合酶协同降解植物生物质的方法，包括以下步骤：1)生物质原料前处理；2)生物质原料水热预处理；3)嗜热毁丝霉的培养；4)嗜热毁丝霉粗酶液的制备；5)水热预处理植物生物质原料的嗜热毁丝霉粗酶液降解。
本发明所述的植物生物质原料包括玉米秸秆、小麦秸秆、棉杆、甘蔗渣、玉米芯、木屑、芒草、花生壳中的一种或几种。
本发明所述的植物生物质原料前处理包括清洗、剪切、粉碎至40～60目。
本发明所述的植物生物质原料，其特征在于，多种生物质原料水热预处理时，各原料按照等质量进行混合。
本发明步骤2)所述的生物质原料水热预处理参数为：生物质原料水热预处理是在具有聚四氟乙烯内衬的不锈钢高压反应釜中进行。水热预处理参数为：生物质原料与蒸馏水按照一定固液比混合浸润后，一并加入高温高压反应釜反应罐中，加热到预设的温度后，恒温处理保持一定时间，反应结束后迅速冷却至室温。
本发明步骤3)所述的嗜热毁丝霉培养参数为：以葡萄糖土豆汁培养基为进行嗜热毁丝霉的培养，培养条件为30～50℃，180～200rpm振荡培养5～7d。
本发明步骤4)所述的嗜热毁丝霉粗酶液的制备是指，将嗜热毁丝霉发酵液离心分别收集菌体和发酵液，菌体经超声波破碎后离心收集提取液；将发酵液与提取液混合后，以60％～85％(w/w)的硫酸铵沉淀、离心后收集蛋白，并以0.2mph5.0～6.5pbs缓冲液溶解蛋白沉淀、并经透析去除硫酸铵后得到嗜热毁丝霉粗酶液。
本发明步骤5)所述的植物生物质原料降解是指，将步骤4)得到的嗜热毁丝霉粗酶液加入到步骤2)得到的水热预处理植物生物质原料中，调节固液比为1:5～1:50，在50℃保温降解生物质。
本发明步骤2)中所述的水热预处理生物质原料与蒸馏水的固液比为1:5～1:20；预设温度为140℃～220℃；维温时间为5～60min。
本发明步骤4)所述的嗜热毁丝霉菌体超声波破碎的参数为：冰浴下开5～20s，停5～20s，超声时间20～30min。
本发明步骤5)所述的嗜热毁丝霉粗酶液添加浓度为50mg～1g蛋白/100g生物质原料。
【有益效果】
水热预处理对于破解植物生物质抗生物降解屏障具有绿色环保、低成本等优势，但是对于植物生物质原料中木质素降解效果甚微，且当处理温度较低时(≤150℃)半纤维素降解效率也较低；而植物生物质原料微生物预处理菌种多为常温菌剂，存在处理周期较长、糖分损耗较大等问题。嗜热毁丝霉可在50～60℃的高温生长，且可以分泌降解纤维素、半纤维素的酶及多种木质素降解酶。
本发明通过将水热预处理与嗜热毁丝霉混合高温酶制剂协同降解植物生物质，具有如下有益效果：
1)可以降低水热预处理强度，达到节约能源的目的；
2)预处理强度降低后，可减少水热预处理生物质原料中抑制物的浓度，从而有利于降低对酶活性的抑制，提高后续高温酶系生物预处理效果；
3)嗜热毁丝霉分泌的胞内酶与胞外酶具有较强的耐热性，可以在较高的温度下(50℃～60℃)进行生物预处理，从而降低了水热预处理产物冷却能耗，并可与后续纤维素酶解(50℃)衔接，使得植物生物质预处理和酶解过程整体能耗降低。
【具体实施方式】
下面结合实施例对本发明技术方案作进一步阐述。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：
①将玉米秸秆剪短、粉碎至60目，按照固液比1:15加入蒸馏水搅拌均匀，浸润2h后加入到具有聚四氟乙烯内衬的不锈钢高压反应釜中，加热160℃后，恒温维持20min，反应结束后迅速冷却至室温；
②以葡萄糖土豆汁培养基为进行嗜热毁丝霉的培养，培养条件为50℃，180～200rpm振荡培养5d；将培养后的发酵液离心收集嗜热毁丝霉的菌体和发酵液，菌体在冰浴下以超声10s，停10s，超声20min，然后离心收集提取液；将超声后提取液与发酵液混合后，以80％(w/w)的硫酸铵沉淀蛋白质，离心后收集蛋白，并以0.2mph5.0～6.5pbs缓冲液溶解蛋白沉淀、并经透析去除硫酸铵后得到嗜热毁丝霉粗酶液；
③按照添加浓度为500mg蛋白/100g生物质原料将嗜热毁丝霉粗酶液与水热预处理生物质原料进行混合，并加入蒸馏水调节固液比1:20，置于50℃恒温振荡箱中进行生物协同预处理。
按照上述方法，植物生物质中葡聚糖降解率为12.3％，木聚糖降解率为94.3％，木质素降解率为27.6％。
实施例2：
①将棉杆粉碎至60目，按照固液比1:10加入蒸馏水搅拌均匀，浸润2h后加入到具有聚四氟乙烯内衬的不锈钢高压反应釜中，加热180℃后，恒温维持10min，反应结束后迅速冷却至室温；
②以葡萄糖土豆汁培养基为进行嗜热毁丝霉的培养，培养条件为50℃，180～200rpm振荡培养5d；将培养后的发酵液离心收集嗜热毁丝霉的菌体和发酵液，菌体在冰浴下以超声5s，停5s，超声30min，然后离心收集提取液；将超声后提取液与发酵液混合后，以60％(w/w)的硫酸铵沉淀蛋白质，离心后收集蛋白，并以0.2mph5.0～6.5pbs缓冲液溶解蛋白沉淀、并经透析去除硫酸铵后得到嗜热毁丝霉粗酶液；
③按照添加浓度为200mg蛋白/100g生物质原料将嗜热毁丝霉粗酶液与水热预处理生物质原料进行混合，并加入蒸馏水调节固液比1:5，置于50℃恒温振荡箱中进行生物协同预处理。
按照上述方法，植物生物质中葡聚糖降解率为11.6％，木聚糖降解率为97.3％，木质素降解率为26.4％。
实施例3：
①将玉米秸秆剪短、粉碎至60目，按照固液比1:15加入蒸馏水搅拌均匀，浸润2h后加入到具有聚四氟乙烯内衬的不锈钢高压反应釜中，加热160℃后，恒温维持20min，反应结束后迅速冷却至室温；
②以葡萄糖土豆汁培养基为进行嗜热毁丝霉的培养，培养条件为50℃，180～200rpm振荡培养5d；将培养后的发酵液离心收集嗜热毁丝霉的菌体和发酵液，菌体在冰浴下以超声10s，停10s，超声20min，然后离心收集提取液；将超声后提取液与发酵液混合后，以80％(w/w)的硫酸铵沉淀蛋白质，离心后收集蛋白，并以0.2mph5.0～6.5pbs缓冲液溶解蛋白沉淀、并经透析去除硫酸铵后得到嗜热毁丝霉粗酶液；
③按照添加浓度为500mg蛋白/100g生物质原料将嗜热毁丝霉粗酶液与水热预处理生物质原料进行混合，并加入蒸馏水调节固液比1:20，置于50℃恒温振荡箱中进行生物协同预处理。
按照上述方法，植物生物质中葡聚糖降解率为12.3％，木聚糖降解率为93.8％，木质素降解率为27.6％。
实施例4：
①将玉米芯、花生壳分别粉碎至60目，按照等质量混合后，按照固液比1:10加入蒸馏水搅拌均匀，浸润2h后一并加入到具有聚四氟乙烯内衬的不锈钢高压反应釜中，加热160℃后，恒温维持20min，反应结束后迅速冷却至室温；
②以葡萄糖土豆汁培养基为进行嗜热毁丝霉的培养，培养条件为50℃，180～200rpm振荡培养5d；将培养后的发酵液离心收集嗜热毁丝霉的菌体和发酵液，菌体在冰浴下以超声15s，停5s，超声20min，然后离心收集提取液；将超声后提取液与发酵液混合后，以80％(w/w)的硫酸铵沉淀蛋白质，离心后收集蛋白，并以0.2mph5.0～6.5pbs缓冲液溶解蛋白沉淀、并经透析去除硫酸铵后得到嗜热毁丝霉粗酶液；
③按照添加浓度为500mg蛋白/100g生物质原料将嗜热毁丝霉粗酶液与水热预处理生物质原料进行混合，并加入蒸馏水调节固液比1:20，置于50℃恒温振荡箱中进行生物协同预处理。
按照上述方法，植物生物质中葡聚糖降解率为14.1％，木聚糖降解率为94.2％，木质素降解率为32.6％。
实施例5：
①将小麦秸秆、甘蔗渣、玉米芯、木屑、棉杆分别粉碎至40目，按照等质量混合后，按照固液比1:20加入蒸馏水搅拌均匀，浸润2h后加入到具有聚四氟乙烯内衬的不锈钢高压反应釜中，加热160℃后，恒温维持20min，反应结束后迅速冷却至室温；
②以葡萄糖土豆汁培养基为进行嗜热毁丝霉的培养，培养条件为50℃，180～200rpm振荡培养5d；将培养后的发酵液离心收集嗜热毁丝霉的菌体和发酵液，菌体在冰浴下以超声20s，停10s，超声20min，然后离心收集提取液；将超声后提取液与发酵液混合后，以75％(w/w)的硫酸铵沉淀蛋白质，离心后收集蛋白，并以0.2mph5.0～6.5pbs缓冲液溶解蛋白沉淀、并经透析去除硫酸铵后得到嗜热毁丝霉粗酶液；
③按照添加浓度为100mg蛋白/100g生物质原料将嗜热毁丝霉粗酶液与水热预处理生物质原料进行混合，并加入蒸馏水调节固液比1:10，置于50℃恒温振荡箱中进行生物协同预处理。
按照上述方法，植物生物质中葡聚糖降解率为13.2％，木聚糖降解率为93.5％，木质素降解率为36.3％。
实施例6：
①将玉米秸秆、木屑、芒草、花生壳分别粉碎至60目，按照等质量混合后，按照固液比1:10加入蒸馏水搅拌均匀，浸润2h后加入到具有聚四氟乙烯内衬的不锈钢高压反应釜中，加热140℃后，恒温维持60min，反应结束后迅速冷却至室温；
②以葡萄糖土豆汁培养基为进行嗜热毁丝霉的培养，培养条件为50℃，180～200rpm振荡培养5d；将培养后的发酵液离心收集嗜热毁丝霉的菌体和发酵液，菌体在冰浴下以超声10s，停5s，超声30min，然后离心收集提取液；将超声后提取液与发酵液混合后，以80％(w/w)的硫酸铵沉淀蛋白质，离心后收集蛋白，并以0.2mph5.0～6.5pbs缓冲液溶解蛋白沉淀、并经透析去除硫酸铵后得到嗜热毁丝霉粗酶液；
③按照添加浓度为200mg蛋白/100g生物质原料将嗜热毁丝霉粗酶液与水热预处理生物质原料进行混合，并加入蒸馏水调节固液比1:25，置于50℃恒温振荡箱中进行生物协同预处理；
按照上述方法，植物生物质中葡聚糖降解率为11.5％，木聚糖降解率为95.2％，木质素降解率为27.6％。
实施例7：
①将小麦秸秆、玉米芯、木屑、花生壳分别粉碎至60目，按照等质量混合后，按照固液比1:20加入蒸馏水搅拌均匀，浸润2h后加入到具有聚四氟乙烯内衬的不锈钢高压反应釜中，加热220℃后，恒温维持5min，反应结束后迅速冷却至室温；
②以葡萄糖土豆汁培养基为进行嗜热毁丝霉的培养，培养条件为50℃，180～200rpm振荡培养5d；将培养后的发酵液离心收集嗜热毁丝霉的菌体和发酵液，菌体在冰浴下以超声10s，停10s，超声30min，然后离心收集提取液；将超声后提取液与发酵液混合后，以80％(w/w)的硫酸铵沉淀蛋白质，离心后收集蛋白，并以0.2mph5.0～6.5pbs缓冲液溶解蛋白沉淀、并经透析去除硫酸铵后得到嗜热毁丝霉粗酶液；
③按照添加浓度为500mg蛋白/100g生物质原料将嗜热毁丝霉粗酶液与水热预处理生物质原料进行混合，并加入蒸馏水调节固液比1:50，置于50℃恒温振荡箱中进行生物协同预处理；
按照上述方法，植物生物质中葡聚糖降解率为16.8％，木聚糖降解率为100％，木质素降解率为37.2％。