一种检测TORCH病原体的基因芯片和试剂盒的制作方法

本发明属于体外基因检测
技术领域：
，特别涉及一种检测torch病原体的基因芯片和试剂盒。
背景技术：
：torch指可导致先天性宫内感染及围产期感染而引起围产儿畸形的病原体，它是一组病原微生物的英文名称缩写，其中t(toxoplasma)是弓形虫，o(others)是其他病原微生物，如梅毒螺旋体、带状疱疹病毒、细小病毒b19、柯萨奇病毒等，r(rubella.virus)是风疹病毒，c(cytomegalo.virus)是巨细胞病毒，h(herpes.virus)即是单纯疱疹i/ii型，由此组病原体所引起的感染称之为torch感染。弓形虫(toxoplasmagondii)也叫三尸虫，属于专性细胞内寄生虫，球虫亚纲，真球虫目，等孢子球虫科、弓形体属。弓形虫可随血液流动到达全身各部位，破坏大脑、心脏、眼底，致使人的免疫力下降，从而导致多种疾病发生。弓形虫属于形体最小、结构简单的一类叫作原虫的寄生虫。猫和其他猫科动物是弓形虫的终宿主，它寄生在这些动物的小肠上皮细胞内，形成囊合子，随粪便排出，其他哺乳动物和鸟吃进去发生感染，在它们身体的组织内发育成为包囊。弓形虫的传播主要通过三种途径：1、通过土壤、水等环境中的弓形虫卵囊被摄入体内；2、通过食入未煮熟的感染有弓形虫的肉类；3、母婴传播。孕妇在怀孕期间发生原发性感染后，可以通过胎盘传染给胎儿，先天性感染是最重要的一种感染途径。感染巨细胞病毒(cmv)能引起孕妇宫内胎儿生长迟缓、小头形、脑炎、视网膜脉膜炎、黄疸、肝脾肿大、溶血性贫血等，新生儿死亡率较高，围产期母乳排毒所致的cmv感染率为63％。单纯疱疹病毒(hsvi型、hsvii型)通常潜伏在神经节。妊娠时母体的生理变化使hsv活化，孕早期感染能破坏胚芽面导致流产，孕中晚期虽少发畸胎，但可引起胎儿和新生儿发病。从上可知，对孕妇进行上述病原体感染情况的检测对孕妇和胎儿的健康具有重要意义。而目前对上述病原体的检测手段主要有两种：1.elisa检测，检测灵敏度较低，检测存在窗口期；2、荧光pcr检测，能够较好检测病原体感染情况，灵敏度较高。缺点是荧光pcr法需要较为昂贵的实时荧光pcr检测系统，对检测环境要求较高，低等级医院达不到检测条件。因此，本发明希望提供一种可同时检测上述多种torch病原体的产品，并能够具有快速简便、特异性强、灵敏度高的优点。技术实现要素：本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种检测torch病原体的基因芯片和试剂盒，具有特异性好、准确性高、快速简便、可同时检测多种torch病原体等优点。一种检测torch病原体的基因芯片，包括生物传感器及固定在生物传感器上的检测探针；所述检测探针包括tox探针、cmv探针、hsvi探针和hsvii探针，其序列依次为seqidno.1-4。优选的，所述检测探针的5’端设置有6-20个单核苷酸组成的重复序列。所述重复序列包括但不限于以下类型：aaaaaaa、aaaaaaaaaaa、ttttttttttttttttt。通过加入重复序列，避免检测探针序列与芯片结合后，位置太近，影响探针与目标dna发生杂交反应。优选的，所述基因芯片上还包括阳性质控探针和阴性质控探针。阳性质控探针可以与血液中人基因组的一段序列进行配对，杂交，显示信号。有阳性质控，可以保证在核酸提取是提取到了核酸dna，这段核酸参加扩增、进行杂交都是成功的，过程及试剂组分都没有失效，能够正产工作，产生信号。阳性质控探针可选用人类基因组中经典内标基因(如β-actin基因)作为设计的靶序列。阴性质控探针是与目标靶序列不能配对的序列，试剂正常情况下是不会出信号的。如果出了信号就是试剂一组分出现问题或是试剂的杂交特异性出现问题，则检测结果不可信。所述阴性质控探针为一段随机序列，长度在30-40bp之间，与tox、cmv、hsvi、hsvii及内标序列均无同源性序列。更优选的，所述阳性质控探针序列为seqidno.5，所述阴性质控探针序列为seqidno.6。优选的，所述基因芯片上还包括polya(多聚腺苷酸)探针。polya探针主要起定位作用，从而分辨各探针在基因芯片上所处的位置。所述基因芯片的制备方法，包括以下步骤：(1)在衬底上镀膜，得到生物传感器；(2)在生物传感器上覆盖涂层，经6-肼基烟酸琥珀酰亚胺酯盐酸盐处理后，水洗；(3)将探针点样在生物传感器上，制得基因芯片。本技术在整个流程中仅将目标基因进行扩增，无需荧光标记进行信号显示，扩增产物上标记的生物素(bio)标记产物与芯片杂交，通过芯片杂交染色、显色，得到结果信号。优选的，步骤(1)中所述衬底为硅片，硅片的厚度为2.5mm，直径为20-25cm。优选的，步骤(1)中镀膜为在硅片上镀上厚度为45-50nm的氮化硅及12-15nm的tsps(t结构聚氨二甲基硅烷烃)薄膜。优选的，步骤(2)中所述涂层为多聚苯丙氨酸-赖氨酸涂层，多聚苯丙氨酸-赖氨酸涂层的厚度为15nm；6-肼基烟酸琥珀酰亚胺酯盐酸盐的浓度为1-10μmol/l，6-肼基烟酸琥珀酰亚胺酯盐酸盐处理的时间为15-25min。优选的，步骤(3)中采用醛基或氨基对探针在生物传感器的点样端进行修饰。优选的，步骤(3)中每种检测探针的点样数不少于2个。为保证检测的准确性和重复性，因此每种检测torch病原体的探针在基因芯片上的点样数应不少于2个。一种检测torch病原体的试剂盒，包括上述基因芯片、检测引物和rpa相关酶。所述rpa相关酶包括能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链dna结合蛋白(ssb)和链置换dna聚合酶。优选的，所述检测引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物包括tox-f、cmv-f、hsvi-f和hsvii-f，其序列依次为seqidno.7-10；所述下游引物包括tox-r、cmv-r、hsvi-r和hsvii-r，其序列依次为seqidno.11-14，所述下游引物的5’端标记有生物素(bio)。本发明是根据rpa(重组酶聚合酶等温扩增)技术所设计的检测引物和检测探针，rpa引物的设计目前没有较好的规则可以确定和参考，需要靠经验及实验不断优化。为同时检测多种病原体，需要设计多条引物，而增加引物对数势必会提高引物设计难度。同时，设计多种不同的探针还需要考虑探针的平衡性，探针越多，设计难度就越大。将所述探针及引物与基因芯片相结合，具有简便、特异性好、灵敏度高的优势。优选的，所述试剂盒还包括阳性质控引物，其上游引物序列为seqidno.15，下游引物序列为seqidno.16，所述下游引物的5’端标记有生物素。优选的，所述试剂盒还包括杂交缓冲液、洗涤液、bw反应液(辣根过氧化物酶+柠檬酸钠缓冲液)和tmb(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)显色液。更优选的，所述杂交缓冲液包括0.3mol/l柠檬酸三钠、3mol/l氯化钠、0.3mol/l十二烷基磺酸钠和tritonx–1000.1％水溶液。所述试剂盒的使用方法，包括以下步骤：(1)提取待测物的dna，采用所述引物和rpa相关酶进行等温扩增，得到扩增产物；(2)在基因芯片上加入扩增产物和杂交缓冲液，进行反应；(3)用0.1×ssc溶液对基因芯片进行洗涤，洗涤后风干；(4)取bw反应液于基因芯片上，在室温条件下反应；(5)加入tmb显色液进行显色，加入tmb显色液的前后均使用0.1×ssc溶液对基因芯片进行洗涤并风干，通过拍照或肉眼读取检测结果。所述试剂盒与待测物进行的检测为杂交反应，当待测物中含有与探针能特异性结合的目的基因片段时，该探针所对应的基因芯片区域显色。优选的，步骤(1)中扩增过程为：37-42℃下反应15-35min。优选的，步骤(2)中扩增产物的加入量为10μl，杂交缓冲液为100μl；反应的条件为：在50-60℃的条件下反应30-60min。优选的，步骤(3)中0.1×ssc溶液的温度为50℃，进行洗涤的时间为1min。优选的，步骤(4)中bw反应液的加入量为100μl，反应时间为10min。优选的，步骤(5)中tmb显色液的加入量为100μl，反应时间为5min；用ssc溶液在加入tmb显色液的前后各洗涤3次，每次1min，并对芯片表面进行风干。相对于现有技术，本发明的有益效果如下：(1)采用基因芯片的方法，实现了多种torch病原体的同时检测，减少了检测时间和成本；(2)本发明通过特异性探针和引物的选择，结合基因芯片的方法，具有特异性好、准确性高和快速方便的优势；(3)通过基因芯片的可见光光学放大，能达到较高的信号分辨率；(4)检测结果可由拍照或肉眼直接读取，简单方便；(5)本发明不需要使用pcr仪进行循环变温操作，采用rpa技术实现恒温扩增，因而仪器简单，成本低。附图说明图1为实施例5中对临床样品的检测结果。具体实施方式为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例对本发明要求的保护范围不构成限制作用。以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。实施例1本实施例提供一种检测torch病原体的基因芯片，包括生物传感器及固定在生物传感器上的检测探针、阳性质控探针(序列为seqidno.5)、阴性质控探针(序列为seqidno.6)和polya探针(序列为：aaaaaaaaaaaaaaaaaa)；上述检测探针包括tox探针、cmv探针、hsvi探针和hsvii探针，其序列依次为seqidno.1-4。其中每条检测探针的5’端还设置有6-20个单核苷酸(t)组成的重复序列。该基因芯片的制备方法，具体包括以下步骤：通过旋转真空镀膜机和真空气相沉淀法在厚度约为2.5mm，直径20cm的硅片上镀上厚度为47.5nm的氮化硅及13.5nm的tsps的薄膜，制备出相应的生物传感器，并覆盖15nm的多聚苯丙氨酸-赖氨酸涂层，最后经过10μmol/l6-肼基烟酸琥珀酰亚胺酯盐酸盐处理20分钟，用清水洗净芯片。将上述用于检测高血压药物治疗相关基因的探针的5’端用醛基修饰后，将检测探针点样至处理好的芯片上，每组设两个平行点样点；在室温下反应，制备出包含探针的基因芯片。基因芯片上的排列方法如表1所示：表1：基因芯片探针点样排列tox探针tox探针cmv探针cmv探针polya探针hsvi探针hsvi探针hsvii探针hsvii探针阳性质控探针阳性质控探针阴性质控探针阴性质控探针polya探针由于polya探针主要起定位作用，因此在基因芯片上只点样上、下两行便可。实施例2一种检测torch病原体的试剂盒，包括实施例1中的基因芯片、检测引物、阳性质控引物(序列为seqidno.15-16)和rpa相关酶，还包括杂交缓冲液、洗涤液、bw反应液(辣根过氧化物酶+柠檬酸钠缓冲液)和tmb(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)显色液。rpa相关酶包括能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链dna结合蛋白(ssb)和链置换dna聚合酶。检测引物包括上游引物和下游引物，其中上游引物包括tox-f、cmv-f、hsvi-f和hsvii-f，其序列依次为seqidno.7-10；所述下游引物包括tox-r、cmv-r、hsvi-r和hsvii-r，其序列依次为seqidno.11-14，所述下游引物的5’端标记有生物素(bio)。将该试剂盒用于多种torch病原体，所构建的pcr反应体系如表2所示：表2：pcr反应体系组成体系组成体积(μl)buffera20bufferb20每种上游引物(10umol/ml)2每种下游引物(10umol/ml)2模板2.5bufferc2.5其中buffera包括20％peg35000、10％海藻糖、250mm磷酸肌酸、12.5mm二硫苏糖醇、250mmtris-hcl、12.5mmdntps和5mmatp；bufferb为500ngreca重组酶、360ng单链结合蛋白、25ng磷酸激酶酶、150ngbsu聚合酶和75ng大肠杆菌外切酶ⅲ；bufferc为280mm醋酸镁溶液；模板为待测物dna。实施例3将经who国际标准品(世界卫生组织国际弓形虫dna标准，nibsc代码：10/242)标定的tox阳性参考品，使用tox阴性的全血稀释至1×102iu/ml、5×102iu/ml、1×103iu/ml、1×104iu/ml、1×105iu/ml，分别标记为l5、l4、l3、l2、l1。采用实施例2中制得的试剂盒对上述不同浓度tox质粒参考品进行扩增和检测，每个参考品重复20次。具体检测方法为：将待检质粒加入pcr反应体系中，使得反应总体积为50μl，制得pcr反应混合液。将上述pcr反应混合液进行扩增，扩增的条件为：40℃下反应30min。扩增完成后，将pcr的扩增产物95℃加热3分钟，迅速置于冰上；取10μl扩增产物至所制得芯片上；取100μl杂交缓冲液于芯片上，在55℃反应60分钟；将芯片置于50℃的0.1×ssc溶液中洗涤1min，对芯片表面进行风干；取100μlbw反应液于芯片上，室温下反应10分钟；用0.1×ssc溶液清洗芯片3次，每次1分钟，对芯片表面进行风干；取100μltmb显色液于芯片表面，反应5分钟；用0.1×ssc溶液清洗芯片3次，每次1分钟，对芯片表面进行风干，通过拍照或肉眼读取检测结果。记录检测结果的阴阳性，检测结果如表3所示。阳性结果用“+”标识，阴性结果用“-”标识。表3：tox阳性参考品的灵敏性检测结果根据表3可知，实施例2中制得的试剂盒对1×103iu/ml的参考品能够稳定地检测出阳性结果，5×102iu/ml参考品检出率也能够达到95％，因此实施例2制备的基因芯片可以准确地对tox5×102iu/ml参考品进行检测，具有检测灵敏度高的特点。实施例4选取浓度为5×105copies/ml的cmv临床样本、tox临床样本、hsvi临床样本、hsvii临床样本作为阳性参考品，选取浓度为5×107copies/ml的hpv样本、hbv样本、hcv样本、ct样本、uu样本、tp标本、ng标本作为阴性参考品，使用实施例2中制得的试剂盒对上述样品进行检测，每种样品平行检测检测，分析产品的特异性，检测结果如表4所示。检测方法为：将上述各样品加入pcr反应体系中，使得反应总体积为50μl，制得pcr反应混合液。将上述pcr反应混合液进行扩增，扩增的条件为：40℃下反应30min。扩增完成后，将pcr的扩增产物95℃加热3分钟，迅速置于冰上；取10μl扩增产物至所制得芯片上；取100μl杂交缓冲液于芯片上，在55℃反应60分钟；将芯片置于50℃的0.1×ssc溶液中洗涤1min，对芯片表面进行风干；取100μlbw反应液于芯片上，室温下反应10分钟；用0.1×ssc溶液清洗芯片3次，每次1分钟，对芯片表面进行风干；取100μltmb显色液于芯片表面，反应5分钟；用0.1×ssc溶液清洗芯片3次，每次1分钟，对芯片表面进行风干，通过拍照或肉眼读取检测结果。表4：特异性标本检测结果注：“++”表示检测结果为阳性，病原体检测准确；“+－”表示结果为阳性，病原体检测不准确，“－”表示结果为阴性。表4的检测结果显示，本发明实施例2制得的试剂盒产品可实现对阳性标准品和阴性标准品的准确检测，具有良好的特异性和检出准确性。实施例5分别取tox阳性、cmv阳性、hsvi阳性、hsvii阳性的临床血液，混匀后取样本50μl，加入核酸释放剂50μl，混匀，静置5分钟，离心，上清备用。将加入上清2μl加入pcr反应体系中，再加入醋酸镁溶液2.5μl(280mmol/l)，于40℃反应30min，取出反应管，向管中加入50μl苯酚/氯仿溶液，充分混匀后，离心。取上清10μl于基因芯片上进行杂交。取100μl杂交缓冲液于芯片上，在50℃反应30分钟；用预热的naoh溶液洗涤3次，每次5-10s；将芯片置于50℃0.1×ssc溶液中洗涤1min，空气吹干芯片表面；取bw反应液100μl于芯片上，室温反应10分钟；用0.1×ssc溶液清洗3次，每次1分钟，空气吹干芯片表面；取100μltmb显色液于芯片表面，反应5分钟；用0.1×ssc溶液清洗3次，每次1分钟，空气吹干芯片表面，照相机拍照或肉眼阅读信号。检测结果如图1所示，tox探针、cmv探针、hsvi探针、hsvii探针和阳性质控探针在基因芯片的点样处(分别为区域1-5)均显蓝色，polya探针点样处(区域a)也显蓝色，阴性质控点样处(区域6)不显色，表明本发明所制得的基因芯片和试剂盒能够准确检出混合临床样本中所含多种torch病原体种类，具有准确性好和简便的特点。sequencelisting<110>珠海赛乐奇生物技术股份有限公司<120>一种检测多种torch病原体的基因芯片和试剂盒<130>1<160>16<170>patentinversion3.5<210>1<211>18<212>dna<213>人工序列<400>1gctcccctctgctggcga18<210>2<211>21<212>dna<213>人工序列<400>2ggacacacccggcacacccag21<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列<400>3acgctgggagccggcccgcc20<210>4<211>21<212>dna<213>人工序列<400>4ggacacacccggcacacccag21<210>5<211>19<212>dna<213>人工序列<400>5gtccaccttccagcagatg19<210>6<211>20<212>dna<213>人工序列<400>6agctagctagctagctagct20<210>7<211>38<212>dna<213>人工序列<400>7aagagacgctaatgtgtttgcataggttgcagtcactg38<210>8<211>38<212>dna<213>人工序列<400>8ctgataaccaagcctgaggttatcagtgtaatgaagcg38<210>9<211>38<212>dna<213>人工序列<400>9ccgcagcccgggaggacgaggagcggccagaggaggag38<210>10<211>39<212>dna<213>人工序列<400>10gcctcgacaaggaggcgcccaagcgcccggccgtgcctc39<210>11<211>39<212>dna<213>人工序列<400>11catagacacgttgaaaccacataagcgtctaaccagcgg39<210>12<211>39<212>dna<213>人工序列<400>12ccggctaggagactctcagacgagaggatgcgcacacct39<210>13<211>38<212>dna<213>人工序列<400>13caggaactggggtgaaggcccaaagtgcacttggggca38<210>14<211>38<212>dna<213>人工序列<400>14caaactgaaacggtcggacatggggtcgtagtaggtcc38<210>15<211>39<212>dna<213>人工序列<400>15ctggcacccagcacaatgaagatcaagatcattgctcct39<210>16<211>41<212>dna<213>人工序列<400>16ctagtcgttcgtcctcatactgctcaggccggggaggtagc41当前第1页12