一种检测中华鳖黄病毒的特异性引物、探针及试剂盒的制作方法

文档序号:23339143发布日期:2020-12-18 16:33阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种中华鳖黄病毒,其特征在于所述的中华鳖黄病毒部分基因序列如seqidno.1所示。

2.一种检测权利要求1所述的中华鳖黄病毒的特异性引物组,其特征在于,所述特异性引物组包括核苷酸序列如seqidno.4所示的tsfv-f1和核苷酸序列如seqidno.5所示的tsfv-r1。

3.一种与权利要求2所述检测中华鳖黄病毒配合使用的探针,其特征在于,所述探针核苷酸序列如seqidno.6所示。

4.一种标准质粒,其特征在于,所述的质粒中如含有seqidno.7所示的中华鳖黄病毒标准品序列。

5.如权利要求4所述的标准质粒的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:对seqidno.7所示的中华鳖黄病毒标准品序列进行pcr扩增,利用特异性引物p1/p2扩增1500bp的靶序列,采用基因克隆技术,将靶序列与t载体进行连接,构建含有1500bp特异性序列的阳性重组质粒;所述的特异性引物p1序列如seqidno.2所示,特异性引物p2序列如seqidno.3所示。

6.一种检测中华鳖黄病毒的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒中包括权利要求2所述的特异性引物组、权利要求3所述的探针和权利要求4所述的标准质粒。

7.如权利要求6所述的检测中华鳖黄病毒的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒中还包括4×taqmanfastvirus1-stepmastermix和depc水。

8.如权利要求6所述的检测中华鳖黄病毒的试剂盒,其特征在于,所述特异性引物组浓度为18μm,探针的浓度为5μm。

9.一种利用权利要求8所述的试剂盒检测中华鳖黄病毒的检测方法,其特征在于,包括如下步骤:利用所述的引物组与探针进行荧光定量pcr扩增待测样品,设depc水为阴性对照,标准质粒为阳性对照,荧光信号设定为fam荧光素,每个循环结束收集荧光信号;

结果判断:(1)ct值≤35且出现典型扩增曲线,判定为tsfvrt-qpcr结果阳性;检测无扩增曲线,或ct值≥40,判定为tsfvrt-qpcr结果阴性;(2)对于35<ct值<40的样品,应进行重复检测;若复检后,ct值≤35且出现典型扩增曲线,判定为tsfvrt-qpcr结果阳性,否则判定为tsfvrt-qpcr结果阴性。

10.一种权利要求2所述的引物组或权利要求3所述的探针或权利要求4所述的标准质粒或权利要求6-8任一项所述的试剂盒在检测中华鳖黄病毒中的应用。


技术总结
本发明公开了一种检测中华鳖黄病毒的特异性引物、探针及试剂盒,属于生物检测技术领域。本发明通过收集病鳖组织样本,进行病原分析,证明引发该病的病原为一种病毒。采用RACE技术获得病毒的部分序列后,针对性的设计了特异性检测该病毒的引物组、探针及试剂盒,提供了灵敏、特异、快速检测中华鳖黄病毒的方法,填补了目前尚无中华鳖黄病毒检测方法的空白,适合中华鳖黄病毒病的确诊、筛查和预防。本发明将为苗种检疫提供技术支撑,为从源头上切断病毒传播提供工具,有利于中华鳖养殖产业的绿色可持续发展。

技术研发人员:袁雪梅;刘莉;吕孙建;张海琪
受保护的技术使用者:浙江省淡水水产研究所;浙江省农业科学院
技术研发日:2020.10.29
技术公布日:2020.12.18
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