wssv的vp28基因的核苷酸序列和所编码的氨基酸序列、以及密码子优化后的核苷酸序列,尤其涉及wssv的vp28蛋白的重组表达制备方法和抗兔多克隆抗体的制备。通过重组表达wssv的vp28蛋白可以进一步在体外分析该蛋白的结构和功能,另外多克隆抗体的制备能够为进一步检测鱼虾内wssv的含量奠定基础。
背景技术:
wssv的vp28是目前研究最多的白斑综合征病毒囊膜蛋白,蛋白是病毒最主要的组成成分之一,包括结构蛋白和非结构蛋白两大类。wssv的结构蛋白包括囊膜蛋白、核衣壳蛋白和被膜蛋白三个部分,它们维持着病毒的基本结构,并保护病毒的核酸,同时参与病毒对宿主组织细胞的识别、吸附及侵入。非结构蛋白大多是一些催化、调节病毒复制的酶类和调控蛋白。
技术实现要素:
为解决上述技术问题,本发明提供了白斑综合征病毒vp28基因、重组蛋白、多克隆抗体及制备方法和应用,以解决缺少克氏原螯虾wssvvp28检测抗体,无法进行wssv测定等问题。
本发明的技术方案如下:
一种白斑综合征病毒vp28基因,所述vp28基因命名为wssvvp28,序列如sedidno:1所示。
一种密码子优化后的白斑综合征病毒vp28基因,其序列如sedidno:2所示。
一种白斑综合征病毒vp28重组蛋白,其氨基酸序列如sedidno:3所示。
一种白斑综合征病毒vp28重组蛋白的制备方法,包括:将白斑综合征病毒vp28密码子优化基因序列sedidno:2连入pet-b2m表达载体得到pet-b2m-wssvvp28重组质粒;
将pet-b2m-wssvvp28重组质粒转化入大肠杆菌中,培养,诱导,裂解,纯化,得到白斑综合征病毒vp28重组蛋白。
在一些实施例中,将密码子优化后的序列seqidno.2进行合成,并直接连入pet-b2m载体,转化进入大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞,iptg诱导表达,收集菌体进行sds-page蛋白检测,超声破碎裂解细菌,纯化重组蛋白。
进一步的,转化步骤为:向感受态细胞e.colibl21中加入pet-b2m-wssv-vp28重组质粒,轻轻混匀,在冰浴中静置5min,后置于42℃水浴热激90s,迅速转移至冰浴中。向每个离心管中加入900μl的无菌lb培养基,混匀后置于37℃摇床振荡培养45min,使菌体复苏,然后吸取100μl复苏的菌液涂布在含有卡纳青霉素抗性的lb固体培养基上,37℃培养12-16h。
进一步的,诱导表达步骤为:挑选含有重组质粒的大肠杆菌,加入液体培养基,37℃震荡培养直至菌液od600=0.4~0.6,加入适量iptg至终浓度1mm,诱导表达4h后,收集菌体,并用灭菌水重悬菌体,放入-80℃冻存,并反复冻融1-2次;取冻融后的重悬菌体在冰浴条件下进行超声波破碎,离心收集破碎后的上清液,并进行sds-page电泳检测。
进一步的,破碎条件为:破碎4s,间隔3s,破碎30min。
进一步的,纯化步骤为:收集超声破碎后的上清液,用ni2+亲和层析柱进行纯化,使用15倍柱体积的bindingbuffer(20mmtris-hclph7.9,5mm咪唑,0.5mnacl)冲洗柱子,洗去杂蛋白;用5mlelutionbuffer(20mmtris-hclph7.9,500mm咪唑,0.5mnacl)洗脱,收集洗脱蛋白。
一种多克隆抗体,是以所述的白斑综合征病毒vp28重组蛋白为抗原,免疫动物制备所得。
上述多克隆抗体的制备方法,以所述的白斑综合征病毒vp28重组蛋白为抗原,采用常规多克隆抗体的制备方法制备抗血清,将抗血清分离纯化得到多克隆抗体。进一步的,包括:将所述的白斑综合征病毒vp28重组蛋白作为抗原注入兔子体内,四次免疫后,采集兔血,分离血清,纯化后得到白斑综合征病毒vp28抗兔多克隆抗体。
在一些实施例中,一种白斑综合征病毒vp28抗兔多克隆抗体的制备方法,包括以下步骤:
采用2只日本大耳兔,将重组wssv的vp28蛋白浓度调整为1mg/ml作为抗原注射,佐剂和抗原为1:1体积比抽取。首免采用完全佐剂,二兔采用不完全佐剂。兔子采用多点皮下注射,每点为0.2ml。首免后第14天进行二免,二免到三免间隔时间为7天。兔子三免后第7天耳中动脉采小样血清检测,检测合格,7天后加免,加免完7天后可采集全血。用elisa(间接法)检测兔血清中抗体效价。然后使用亲和层析柱proteing,纯化抗体,并应用于后续的westernblot等实验。
所述的白斑综合征病毒囊膜蛋白vp28基因是cdna序列:长度615bp,类型是双链、线性、核酸,所述wssvvp28的序列是通过pcr扩增,并进行测序获得。具体序列如下所示,seqidno.1:
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利用dnaworks2.4在线软件,对wssvvp28的核苷酸序列进行密码子优化,选用大肠杆菌表达系统,对wssvvp28序列的密码子优化后的序列,标记seqidno.2:
cataacaccgtgaccaaaaccattgaaacccataccggtaatatcgaaaccaacatggatgaaaatctgcgtattccggttaccgcagaagttggtagcggttatttcaaaatgaccgatgttagctttgatagcgataccctgggcaaaatcaaaattcgcaatggtaaaagtgacgcccagatgaaagaagaggacgcagatctggttattacaccggttgaaggtcgtgcactggaagttaccgttggccagaatctgacctttgaaggcacctttaaagtgtggaataataccagccgcaagattaacattaccggcatgcagatggttccgaaaattaacccgagcaaagcatttgttggtagcagcaataccagcagctttactccggttagcattgatgaagatgaagttggcacctttgtttgtggcaccacctttggtgcaccgattgcagcaaccgcaggcggtaacctgtttgatatgtatgttcatgttacctatagcggcaccgaaaccgaa。
所述的wssvvp28分子类型为蛋白质,序列特征:长度区段:30-204aa,共计175aa,分子量19kd,类型为氨基酸,序列信息如下,标记为seqidno.3:
hntvtktiethtgnietnmdenlripvtaevgsgyfkmtdvsfdsdtlgkikirngksdaqmkeedadlvitpvegralevtvgqnltfegtfkvwnntsrkinitgmqmvpkinpskafvgssntssftpvsidedevgtfvcgttfgapiaataggnlfdmyvhvtysgtete。
本发明所述白斑综合征病毒囊膜蛋白vp28重组蛋白和抗兔多克隆抗体的制备方法,包括以下步骤:
一个白斑综合征病毒囊膜蛋白vp28密码子优化基因的合成;
一个白斑综合征病毒囊膜蛋白vp28重组表达步骤;
一个白斑综合征病毒囊膜蛋白vp28抗兔多克隆抗体的制备方法。
本发明还提供所述的白斑综合征病毒vp28重组蛋白/所述多克隆抗体在白斑综合征病毒检测中的应用。
本发明将wssvvp28密码子优化后的序列seqidno.2直接连入pet-b2m载体,通过转化到大肠杆菌bl21感受态细胞,挑选单克隆进行摇菌,iptg诱导表达,收集菌体进行sds-page蛋白检测,超声破碎裂解细菌,用ni2+亲和层析柱纯化目的蛋白。然后以纯化后的wssvvp28重组蛋白作为抗原,采用5只新西兰白兔,进行免疫,收集血清,用elisa(间接法)检测兔血清中抗体效价。然后使用亲和层析柱proteing,纯化抗体,并应用于后续的westernblot等实验。通过重组表达wssvvp28蛋白可以进一步在体外分析该蛋白的结构和功能,另外多克隆抗体的制备能够为进一步检测虾体内wssv的vp28的含量奠定基础。
有益效果:本发明不仅重组表达了具有活性的wssvvp28蛋白,为进一步研究该蛋白功能提供基础,而且生产的多克隆抗体,也为检测虾体内wssv的vp28提供了条件,生产的抗体可为进一步科学研究。
附图说明
图1,wssvvp28重组蛋白的sds-page电泳检测。m表示蛋白marker,1表示未iptg诱导的菌体蛋白,2表示iptg诱导后的菌体蛋白,3表示ni2+纯化后的vp28重组蛋白。
图2,vp28抗体的westernblot检测感染wssv的小龙虾肌肉蛋白样品。
图3,vp28抗兔多克隆抗体效价检测结果。
具体实施方式
实施例1
1.wssvvp28-his重组蛋白的诱导表达:
向感受态细胞e.colibl21中加入pet-b2m-wssvvp28重组质粒,轻轻混匀,在冰浴中静置5min,后置于42℃水浴热激90s,迅速转移至冰浴中。向每个离心管中加入900μl的无菌lb培养基,混匀后置于37℃摇床振荡培养45min,使菌体复苏,然后吸取100μl复苏的菌液涂布在含有卡纳青霉素抗性的lb固体培养基上,37℃培养12-16h。挑选含有重组质粒的大肠杆菌,加入液体培养基,37℃震荡培养直至菌液od600=0.4~0.6,加入适量iptg至终浓度1mm,诱导表达4h后,收集菌体,并用灭菌水重悬菌体,放入-80℃冻存,并反复冻融1-2次;取冻融后的重悬菌体在冰浴条件下进行超声波破碎,离心收集破碎后的上清液,并进行sds-page电泳检测。如图1所示,wssvvp28重组蛋白的sds-page电泳检测。m表示蛋白marker,1表示未iptg诱导的菌体蛋白,2表示iptg诱导后的菌体蛋白,3表示ni2+纯化后的vp28重组蛋白。
从结果可以看出,重组蛋白vp28能够成功大量诱导表达,而且经过ni2+纯化后的条带单一,没有其它杂蛋白,能够满足后续制作多克隆抗体的要求。
2.wssvvp28-his重组蛋白的纯化:
对wssvvp28-his重组蛋白进行分离纯化:将超声破碎后的上清样品负载上ni2+离子亲和层析柱,流速为10倍柱体积/小时,收集流穿液。用15倍柱体积的bindingbuffer(20mmtris-hclph7.9,5mm咪唑,0.5mnacl)冲洗柱子,洗去杂蛋白。使用5mlelutionbuffer(20mmtris-hclph7.9,500mm咪唑,0.5mnacl)洗脱,收集洗脱蛋白。
3.抗兔wssvvp28-his多克隆抗体的制备:
采用2只日本大耳兔,将重组wssvvp28蛋白浓度调整为1mg/ml作为抗原注射,佐剂和抗原为1:1体积比抽取。首免采用完全佐剂,二-四免采用不完全佐剂。兔子采用多点皮下注射,每点为0.2ml。首免后第14天进行二免,二免到三免间隔时间为7天。兔子三免后第7天耳中动脉采小样血清检测,检测合格,7天后加免,加免完7天后可采集全血。用elisa(间接法)检测兔血清中抗体效价。然后使用亲和层析柱proteing,纯化抗体,并应用于后续的westernblot等实验。
4.wssvvp28-his多克隆抗体的westernblot检测:
提取稀有鮈鲫的血清总蛋白,进行sds-page电泳,在湿转法的条件下对血清总蛋白进行pvdf转膜,然后将pvdf膜放在5%的脱脂奶粉中封闭2h,并将纯化后的抗体按照1:3000进行稀释,并孵育2h,用tbst洗膜三次,每次5min,后用羊抗兔hrp标记的igg二抗与pvdf膜孵育2h,再用tbst洗膜三次,最后用增强型的dab显色试剂盒进行显色,并进行观察。
图2为vp28抗体的westernblot检测感染wssv的小龙虾肌肉蛋白样品。
通过westernblot验证,可以看出从感染wssv的小龙虾肌肉样品中能够明显的检测出vp28蛋白条带,并且特异性较好,表明通过本方法生产出的vp28多克隆抗体能够用于检测。
图3为制备得到的vp28抗兔多克隆抗体效价检测结果。
通过elisa实验来验证抗体效价,从结果中可以看出抗体的效价超过1:50000,表明抗体的质量较好,可用于westernblot检测。
序列表
<110>扬州大学
<120>白斑综合征病毒vp28基因、重组蛋白、多克隆抗体及制备方法和应用
<160>3
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