本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一种6-o-棕榈酰基-2-o-α-d-吡喃葡萄糖基-l-抗坏血酸的制备方法。
背景技术：
皮肤美白剂、抗皮肤衰老剂及抗氧化剂等一般经由透皮吸收作用于表皮基底层或真皮层发挥作用。而皮肤角质层的屏障作用会阻碍化妆品经皮吸收的过程，从而减弱化妆品功效。因此，增加角质层的通透性成为提高化妆品性能的关键。
6-o-棕榈酰基-2-o-α-d-吡喃葡萄糖基-l-抗坏血酸是2-o-α-d-吡喃葡萄糖基-l-抗坏血酸经棕榈酸的酰基化作用的产物，保持了l-抗坏血酸抗氧化的生理特性，而且具有一定的脂溶性和水溶性，能很好地透过皮肤角质层屏障，具有优良的透皮吸收作用，从而能够充分发挥抗坏血酸的抗氧化及皮肤美白作用，被广泛应用于化妆品及医药领域。
cn109414393a公开了一种6-酰基-2-o-α-d-糖基-l-抗坏血酸和含有其的组合物及其制造方法，其先以液化淀粉和l-抗坏血酸为原料，在环麦芽糊精葡聚糖转移酶的催化作用下制备了2-o-α-d-吡喃葡萄糖基-l-抗坏血酸，然后与棕榈酸酐反应，合成了6-棕榈酰基-2-o-α-d-吡喃葡萄糖基-l-抗坏血酸。但是，该方法在第一步酶法合成2-o-α-d-吡喃葡萄糖基-l-抗坏血酸时，l-抗坏血酸的5位和/或6位碳上的羟基也会被葡萄糖基取代，生成5(和/或6)-o-α-d-吡喃葡萄糖基-l-抗坏血酸，导致最终产品收率和纯度较低，同时增加了后续分离提纯的难度。
因此，在本领域有待于研究一种副反应更少，收率更高的合成6-o-棕榈酰基-2-o-α-d-吡喃葡萄糖基-l-抗坏血酸的方法。
技术实现要素：
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种6-o-棕榈酰基-2-o-α-d-吡喃葡萄糖基-l-抗坏血酸的制备方法。与现有方法相比，该制备方法减少了副反应，提高了6-o-棕榈酰基-2-o-α-d-吡喃葡萄糖基-l-抗坏血酸产品的产率，降低了后续分离提纯的难度，降低了生产成本。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种6-o-棕榈酰基-2-o-α-d-吡喃葡萄糖基-l-抗坏血酸的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
(1)以5,6-o-异丙叉基-l-抗坏血酸和葡萄糖基供体为原料，水为溶剂，在糖基转移酶的作用下进行葡萄糖基转移反应；
(2)将步骤(1)得到的反应液在葡萄糖淀粉酶的作用下进行水解反应，生成5,6-o-异丙叉基-2-o-α-d-吡喃葡萄糖基-l-抗坏血酸；
(3)将步骤(2)得到的反应液用强酸性阳离子交换树脂进行分离，分离液结晶析出2-o-α-d-吡喃葡萄糖基-l-抗坏血酸；
(4)将所述2-o-α-d-吡喃葡萄糖基-l-抗坏血酸与棕榈酸进行酯化反应，得到6-o-棕榈酰基-2-o-α-d-吡喃葡萄糖基-l-抗坏血酸。
本发明中，经步骤(1)的葡萄糖基转移反应，5,6-o-异丙叉基-l-抗坏血酸的2位碳原子上的羟基被葡萄糖基或多聚葡萄糖基取代，生成5,6-o-异丙叉基-2-o-α-d-吡喃葡萄糖基-l-抗坏血酸和少量5,6-o-异丙叉基-2-o-α-d-吡喃多聚葡萄糖基-l-抗坏血酸；经步骤(2)的水解反应，多聚葡萄糖基被葡萄糖淀粉酶水解为葡萄糖基，得到较纯净的5,6-o-异丙叉基-2-o-α-d-吡喃葡萄糖基-l-抗坏血酸；反应液经强酸性阳离子交换树脂分离，5,6-o-异丙叉基-2-o-α-d-吡喃葡萄糖基-l-抗坏血酸被水解为2-o-α-d-吡喃葡萄糖基-l-抗坏血酸；最后通过步骤(4)的酯化反应，从而得到了较纯净的6-o-棕榈酰基-2-o-α-d-吡喃葡萄糖基-l-抗坏血酸产品。
与现有技术相比，本发明采用5,6-o-异丙叉基-l-抗坏血酸为起始原料与葡萄糖基供体反应，先制得5,6-o-异丙叉基-2-o-α-d-吡喃葡萄糖基-l-抗坏血酸，避免了副产物5(和/或6)-o-α-d-吡喃葡萄糖基-l-抗坏血酸的生成，产物5,6-o-异丙叉基-2-o-α-d-吡喃葡萄糖基-l-抗坏血酸经强酸性阳离子交换树脂分离即可得到较纯净的2-o-α-d-吡喃葡萄糖基-l-抗坏血酸，以参与后续反应，从而提高了最终产品的产率和纯度，降低了后续分离提纯的难度，降低了生产成本。
在本发明一实施方式中，所述葡萄糖基供体选自麦芽糖、寡聚麦芽糖(如麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖、麦芽七糖、麦芽八糖等)、蔗糖、淀粉和淀粉水解物(如糊精、环糊精、直链淀粉、液化淀粉、胶状淀粉及可溶性淀粉等)中的一种或至少两种的组合，优选为环糊精，更优选为β-环糊精。
在本发明一实施方式中，所述葡萄糖基供体与5,6-o-异丙叉基-l-抗坏血酸的质量比为2-3:1；例如可以是2:1、2.2:1、2.3:1、2.5:1、2.6:1、2.8:1或3:1等。
在本发明一实施方式中，所述糖基转移酶选自环糊精葡萄糖基转移酶、α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、蔗糖磷酸化酶和α-异麦芽糖基葡萄糖形成酶中的一种或至少两种的组合，优选为环糊精葡萄糖基转移酶。
在本发明一实施方式中，所述糖基转移酶为固定化糖基转移酶。
固定化糖基转移酶中，糖基转移酶通过物理或化学方法固定在载体上。采用固定化糖基转移酶，一方面有助于提高酶催化反应效率，另一方面便于回收大部分糖基转移酶。本发明对固定化糖基转移酶的载体种类不作特殊限定，示例性的，可以是二氧化硅载体。
在本发明一实施方式中，所述糖基转移酶与5,6-o-异丙叉基-l-抗坏血酸的质量比为0.4-0.5:1；例如可以是0.4:1、0.42:1、0.43:1、0.45:1、0.46:1、0.48:1或0.5:1等。
在本发明一实施方式中，步骤(1)中所述葡萄糖基转移反应是在温度为50-60℃(例如可以是50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃或60℃等)，ph为5-6(例如可以是5、5.2、5.3、5.5、5.6、5.8或6等)的条件下进行。
在本发明一实施方式中，步骤(1)中所述葡萄糖基转移反应的时间为50-60h；例如可以是50h、52h、53h、55h、56h、58h或60h等。
本发明中，通过选择上述反应条件，有助于保证反应的充分进行，提高最终产品的收率和纯度。
在本发明一实施方式中，所述制备方法还包括：在进行步骤(2)中所述水解反应之前，将步骤(1)得到的反应液中的糖基转移酶除去。
在本发明一实施方式中，步骤(2)中所述葡萄糖淀粉酶与步骤(1)中所述5,6-o-异丙叉基-l-抗坏血酸的质量比为1:40-50；例如可以是1:40、1:42、1:43、1:45、1:46、1:48或1:50等。
在本发明一实施方式中，步骤(2)中所述水解反应的温度为50-60℃；例如可以是50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃或60℃等。
在本发明一实施方式中，步骤(2)中所述水解反应的时间为6-60h；例如可以是6h、8h、10h、12h、15h、20h、25h、30h、35h、40h、45h、50h、55h或60h等。
在本发明一实施方式中，所述制备方法还包括：在步骤(3)中所述分离之前，将步骤(2)得到的反应液加热使葡萄糖淀粉酶失活，并用活性炭脱色处理。
在本发明一实施方式中，步骤(3)中所述强酸性阳离子交换树脂为以苯乙烯-二乙烯基共聚物为基体的磺酸基阳离子交换树脂。
在本发明一实施方式中，步骤(4)中所述酯化反应是在无水吡啶中进行。
在本发明一实施方式中，步骤(4)中所述2-o-α-d-吡喃葡萄糖基-l-抗坏血酸与无水吡啶的质量体积比为1g:10-20ml；例如可以是1g:10ml、1g:11ml、1g:12ml、1g:13ml、1g:14ml、1g:15ml、1g:16ml、1g:17ml、1g:18ml、1g:19ml或1g:20ml等。
在本发明一实施方式中，步骤(4)中所述2-o-α-d-吡喃葡萄糖基-l-抗坏血酸与棕榈酸的摩尔比为1:6-8；例如可以是1:6、1:6.2、1:6.3、1:6.5、1:6.6、1:6.8、1:7、1:7.2、1:7.3、1:7.5、1:7.6、1:7.8或1:8等。
在本发明一实施方式中，步骤(4)中所述酯化反应的温度为20-30℃；例如可以是20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃或30℃等。
在本发明一实施方式中，步骤(4)中所述酯化反应的时间为2-3h；例如可以是2h、2.2h、2.3h、2.5h、2.6h、2.8h或3h等。
在本发明一实施方式中，在步骤(4)中所述酯化反应结束后进行固液分离，固体产物经水洗、乙醇结晶和干燥后，得到6-o-棕榈酰基-2-o-α-d-吡喃葡萄糖基-l-抗坏血酸。
本发明中，对5,6-o-异丙叉基-l-抗坏血酸的制备方法不作特殊限定，示例性地，可以采用如下方法：
将l-抗坏血酸与丙酮按照l-抗坏血酸:丙酮＝1g:(5～10ml)的比例投料，采用乙酰氯、氧氯化磷、氯化亚锡中的任一种或几种为催化剂进行催化反应，制备得到5,6-o-异丙叉基-l-抗坏血酸。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供的制备方法采用5,6-o-异丙叉基-l-抗坏血酸为起始原料与葡萄糖基供体反应，先制得5,6-o-异丙叉基-2-o-α-d-吡喃葡萄糖基-l-抗坏血酸，避免了副产物5(和/或6)-o-α-d-吡喃葡萄糖基-l-抗坏血酸的生成，结合特定的反应条件，提高了6-o-棕榈酰基-2-o-α-d-吡喃葡萄糖基-l-抗坏血酸产品的产率和纯度，其摩尔收率达到62-83％，纯度达到90-99.5％(当采用优选的葡萄糖基供体和糖基转移酶时，其摩尔收率达到80-83％，纯度达到98.5-99.5％)，降低了后续分离提纯的难度，降低了生产成本。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述具体实施方式仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
本发明实施例中，部分材料来源如下：
直链淀粉(来源于马铃薯)：品牌sigma，cas：9005-82-7；
可溶性淀粉：品牌acmec，br，cas：9005-84-9；
固定化环麦芽糊精葡聚糖转移酶：西安沐森生物工程有限公司，酶活10万u/g；
固定化α-淀粉酶：品牌：acmec，br，酶活≥1500u/g，cas：9000-90-2；
固定化α-葡萄糖苷酶：品牌：acmec，酶活≥5万u/g；
葡萄糖淀粉酶：品牌sigma，酶活7万u/g；
强酸性阳离子交换树脂(或层析柱)：安徽三星树脂科技有限公司，001×7氢型；
5,6-o-异丙叉基-l-抗坏血酸：自制，制备方法如下：
在500ml带搅拌和温度计的干燥三口圆底烧瓶中，加入50g的l-抗坏血酸、300ml的丙酮，并将反应体系置于30℃水浴中，开启搅拌，在强力搅拌下，加入5ml的乙酰氯，反应2h后，再次加入5ml的乙酰氯，继续反应2h后，抽滤，减压干燥，得到白色针状固体，即为5,6-o-异丙叉基-l-抗坏血酸，分子量216.19，测试熔点为217℃。
实施例1
本实施例提供一种6-o-棕榈酰基-2-o-α-d-吡喃葡萄糖基-l-抗坏血酸的制备方法，包括如下步骤：
(1)将100重量份β-环糊精和40重量份5,6-o-异丙叉基-l-抗坏血酸放入1000重量份水中溶解，调节ph至5.5，然后加入20重量份(以环麦芽糊精葡聚糖转移酶计)固定化环麦芽糊精葡聚糖转移酶制剂，在50℃下反应60h，得到含有5,6-o-异丙叉基-2-o-α-d-吡喃葡萄糖基-l-抗坏血酸和少量5,6-o-异丙叉基-2-o-α-d-吡喃多聚葡萄糖基-l-抗坏血酸的反应液；
(2)将步骤(1)得到的反应液过滤，移去固定化环麦芽糊精葡聚糖转移酶，滤液加热1h，使残留的酶失活，然后添加1重量份葡萄糖淀粉酶，在50℃下反应6h，得到含5,6-o-异丙叉基-2-o-α-d-吡喃葡萄糖基-l-抗坏血酸的反应液
(3)加热步骤(2)得到的反应液，使葡萄糖淀粉酶失活，加热后的反应液添加活性炭脱色处理，经离心后过滤，滤液过填充有强酸性阳离子交换树脂的层析柱进行分离，分离液降温至5℃，结晶析出2-o-α-d-吡喃葡萄糖基-l-抗坏血酸，40℃真空干燥；
(4)将干燥后的2-o-α-d-吡喃葡萄糖基-l-抗坏血酸按质量体积比1g:12ml溶于无水吡啶中，加入棕榈酸(2-o-α-d-吡喃葡萄糖基-l-抗坏血酸与棕榈酸的摩尔比为1:6)，20℃下反应1.5h，离心，过滤，滤饼回收后水洗2次，用乙醇结晶，真空干燥，得到6-o-棕榈酰基-2-o-α-d-吡喃葡萄糖基-l-抗坏血酸产品，经液相色谱检测，纯度为99.5％，摩尔收率为82.3％(以5,6-o-异丙叉基-l-抗坏血酸计)。
实施例2
本实施例提供一种6-o-棕榈酰基-2-o-α-d-吡喃葡萄糖基-l-抗坏血酸的制备方法，包括如下步骤：
(1)将130重量份β-环糊精和50重量份5,6-o-异丙叉基-l-抗坏血酸放入1000重量份水中溶解，调节ph至5.5，然后加入20重量份(以环麦芽糊精葡聚糖转移酶计)固定化环麦芽糊精葡聚糖转移酶制剂，在58℃下反应50h，得到含有5,6-o-异丙叉基-2-o-α-d-吡喃葡萄糖基-l-抗坏血酸和少量5,6-o-异丙叉基-2-o-α-d-吡喃多聚葡萄糖基-l-抗坏血酸的反应液；
(2)将步骤(1)得到的反应液过滤，移去固定化环麦芽糊精葡聚糖转移酶，滤液加热1h，使残留的酶失活，然后添加1重量份葡萄糖淀粉酶，在50℃下反应20h，得到含5,6-o-异丙叉基-2-o-α-d-吡喃葡萄糖基-l-抗坏血酸的反应液
(3)加热步骤(2)得到的反应液，使葡萄糖淀粉酶失活，加热后的反应液添加活性炭脱色处理，经离心后过滤，滤液过填充有强酸性阳离子交换树脂的层析柱进行分离，分离液降温至1℃，结晶析出2-o-α-d-吡喃葡萄糖基-l-抗坏血酸，120℃喷雾干燥；
(4)将干燥后的2-o-α-d-吡喃葡萄糖基-l-抗坏血酸按质量体积比1g:10ml溶于无水吡啶中，加入棕榈酸(2-o-α-d-吡喃葡萄糖基-l-抗坏血酸与棕榈酸的摩尔比为1:8)，25℃下反应2h，过滤，滤饼回收后水洗2次，用乙醇结晶，真空干燥，得到6-o-棕榈酰基-2-o-α-d-吡喃葡萄糖基-l-抗坏血酸产品，经液相色谱检测，纯度为98.7％，摩尔收率为80.9％(以5,6-o-异丙叉基-l-抗坏血酸计)。
实施例3
本实施例提供一种6-o-棕榈酰基-2-o-α-d-吡喃葡萄糖基-l-抗坏血酸的制备方法，包括如下步骤：
(1)将130重量份β-环糊精和50重量份5,6-o-异丙叉基-l-抗坏血酸放入800重量份水中溶解，调节ph至5.6，然后加入20重量份(以环麦芽糊精葡聚糖转移酶计)固定化环麦芽糊精葡聚糖转移酶制剂，在58℃下反应50h，得到含有5,6-o-异丙叉基-2-o-α-d-吡喃葡萄糖基-l-抗坏血酸和少量5,6-o-异丙叉基-2-o-α-d-吡喃多聚葡萄糖基-l-抗坏血酸的反应液；
(2)将步骤(1)得到的反应液过滤，移去固定化环麦芽糊精葡聚糖转移酶，滤液加热1h，使残留的酶失活，然后添加1重量份葡萄糖淀粉酶，在50℃下反应60h，得到含5,6-o-异丙叉基-2-o-α-d-吡喃葡萄糖基-l-抗坏血酸的反应液
(3)加热步骤(2)得到的反应液，使葡萄糖淀粉酶失活，加热后的反应液添加活性炭脱色处理，经离心后过滤，滤液过填充有强酸性阳离子交换树脂的层析柱进行分离，分离液降温至3℃，结晶析出2-o-α-d-吡喃葡萄糖基-l-抗坏血酸，120℃喷雾干燥；
(4)将干燥后的2-o-α-d-吡喃葡萄糖基-l-抗坏血酸按质量体积比1g:20ml溶于无水吡啶中，加入棕榈酸(2-o-α-d-吡喃葡萄糖基-l-抗坏血酸与棕榈酸的摩尔比为1:7)，30℃下反应3h，过滤，滤饼回收后水洗2次，用乙醇结晶，真空干燥，得到6-o-棕榈酰基-2-o-α-d-吡喃葡萄糖基-l-抗坏血酸产品，经液相色谱检测，纯度为99.4％，摩尔收率为81.5％(以5,6-o-异丙叉基-l-抗坏血酸计)。
实施例4
本实施例提供一种6-o-棕榈酰基-2-o-α-d-吡喃葡萄糖基-l-抗坏血酸的制备方法，包括如下步骤：
(1)将100重量份直链淀粉和50重量份5,6-o-异丙叉基-l-抗坏血酸放入1000重量份水中溶解，调节ph至5.0，然后加入23重量份(以环麦芽糊精葡聚糖转移酶计)固定化α-淀粉酶制剂，在60℃下反应55h，得到含有5,6-o-异丙叉基-2-o-α-d-吡喃葡萄糖基-l-抗坏血酸和少量5,6-o-异丙叉基-2-o-α-d-吡喃多聚葡萄糖基-l-抗坏血酸的反应液；
(2)将步骤(1)得到的反应液过滤，移去固定化环麦芽糊精葡聚糖转移酶，滤液加热1h，使残留的酶失活，然后添加1重量份葡萄糖淀粉酶，在60℃下反应10h，得到含5,6-o-异丙叉基-2-o-α-d-吡喃葡萄糖基-l-抗坏血酸的反应液
(3)加热步骤(2)得到的反应液，使葡萄糖淀粉酶失活，加热后的反应液添加活性炭脱色处理，经离心后过滤，滤液过填充有强酸性阳离子交换树脂的层析柱进行分离，分离液降温至5℃，结晶析出2-o-α-d-吡喃葡萄糖基-l-抗坏血酸，120℃喷雾干燥；
(4)将干燥后的2-o-α-d-吡喃葡萄糖基-l-抗坏血酸按质量体积比1g:20ml溶于无水吡啶中，加入棕榈酸(2-o-α-d-吡喃葡萄糖基-l-抗坏血酸与棕榈酸的摩尔比为1:6)，25℃下反应2h，过滤，滤饼回收后水洗2次，用乙醇结晶，真空干燥，得到6-o-棕榈酰基-2-o-α-d-吡喃葡萄糖基-l-抗坏血酸产品，经液相色谱检测，纯度为90.1％％，摩尔收率为72.2％(以5,6-o-异丙叉基-l-抗坏血酸计)。
实施例5
本实施例提供一种6-o-棕榈酰基-2-o-α-d-吡喃葡萄糖基-l-抗坏血酸的制备方法，包括如下步骤：
(1)将150重量份可溶性淀粉和50重量份5,6-o-异丙叉基-l-抗坏血酸放入1000重量份水中溶解，调节ph至6.0，然后加入25重量份(以环麦芽糊精葡聚糖转移酶计)固定化α-葡萄糖苷酶制剂，在55℃下反应60h，得到含有5,6-o-异丙叉基-2-o-α-d-吡喃葡萄糖基-l-抗坏血酸和少量5,6-o-异丙叉基-2-o-α-d-吡喃多聚葡萄糖基-l-抗坏血酸的反应液；
(2)将步骤(1)得到的反应液过滤，移去固定化环麦芽糊精葡聚糖转移酶，滤液加热1h，使残留的酶失活，然后添加1重量份葡萄糖淀粉酶，在55℃下反应30h，得到含5,6-o-异丙叉基-2-o-α-d-吡喃葡萄糖基-l-抗坏血酸的反应液
(3)加热步骤(2)得到的反应液，使葡萄糖淀粉酶失活，加热后的反应液添加活性炭脱色处理，经离心后过滤，滤液过填充有强酸性阳离子交换树脂的层析柱进行分离，分离液降温至5℃，结晶析出2-o-α-d-吡喃葡萄糖基-l-抗坏血酸，120℃喷雾干燥；
(4)将干燥后的2-o-α-d-吡喃葡萄糖基-l-抗坏血酸按质量体积比1g:20ml溶于无水吡啶中，加入棕榈酸(2-o-α-d-吡喃葡萄糖基-l-抗坏血酸与棕榈酸的摩尔比为1:6)，25℃下反应2h，过滤，滤饼回收后水洗2次，用乙醇结晶，真空干燥，得到6-o-棕榈酰基-2-o-α-d-吡喃葡萄糖基-l-抗坏血酸产品，经液相色谱检测，纯度为95.5％，摩尔收率为62.2％(以5,6-o-异丙叉基-l-抗坏血酸计)。
与现有技术相比，本发明提供的制备方法采用5,6-o-异丙叉基-l-抗坏血酸为起始原料与葡萄糖基供体反应，先制得5,6-o-异丙叉基-2-o-α-d-吡喃葡萄糖基-l-抗坏血酸，避免了副产物5(和/或6)-o-α-d-吡喃葡萄糖基-l-抗坏血酸的生成，结合特定的反应条件，从而提高了6-o-棕榈酰基-2-o-α-d-吡喃葡萄糖基-l-抗坏血酸产品的产率和纯度。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。