1.一种用于检测转基因大豆zh10-6的特异性引物及探针,其特征在于包括g2epsps外源插入目的基因序列:
正向引物序列:5’-tcgagattgatggtggtttgtc-3’
反向引物序列:5’-tcagcgccacttcaatcg-3’
探针序列:fam-ccagtacgtatcggccctgctgatg-bhq1;
gat外源插入目的基因序列:
正向引物序列:5’-gggcaaactgatttccatagctt-3’
反向引物序列:5’-cctcggagctggtactgtttct-3’
探针序列:fam-attccaccaggccgagcactcaga-bhq1;
3’端转化体特异性序列:
正向引物序列:5’-accttcggttccacccttgt-3’
反向引物序列:5’-aggaacaaaaggaaacaaaaaataat-3’
探针序列:fam-tagtttccgaggcagacacatcagtt-bhq1;
内源基因lectin基因序列:
正向引物序列:5’-gccctctactccaccccca-3’
反向引物序列:5’-gcccatctgcaagccttttt-3’
探针序列:fam-agcttcgccgcttccttcaacttcac-bhq1。
2.一种采用权利要求1所述用于检测转基因大豆zh10-6的特异性引物及探针精准定量检测转基因耐除草剂大豆zh10-6的方法,其特征在于如下步骤:
(1)g2epsps外源插入目的基因序列:
正向引物序列:5’-tcgagattgatggtggtttgtc-3’
反向引物序列:5’-tcagcgccacttcaatcg-3’
探针序列:fam-ccagtacgtatcggccctgctgatg-bhq1;
gat外源插入目的基因序列:
正向引物序列:5’-gggcaaactgatttccatagctt-3’
反向引物序列:5’-cctcggagctggtactgtttct-3’
探针序列:fam-attccaccaggccgagcactcaga-bhq1;
3’端转化体特异性序列:
正向引物序列:5’-accttcggttccacccttgt-3’
反向引物序列:5’-aggaacaaaaggaaacaaaaaataat-3’
探针序列:fam-tagtttccgaggcagacacatcagtt-bhq1;
内参基因lectin基因序列:
正向引物序列:5’-gccctctactccaccccca-3’,
反向引物序列:5’-gcccatctgcaagccttttt-3’,
探针序列:fam-agcttcgccgcttccttcaacttcac-bhq1;
(2)pcr反应体系:总体积为20μl,包括bio-radddpcrsupermixforprobes10μl,10µmol/l上游引物1μl,10µmol/l下游引物1μl,10µmol/l探针1μl,25ng/μldna模板1μl,最终用无菌水补充至20μl;
(3)微滴生成:将20μl反应体系小心转移至微卡发生器,避免产生气泡,同时与微卡发生器相应位置加入微滴生成油70μl,盖上垫片,放入微滴生成器中生成微滴,微滴生成后用移液器倾斜30-45度吸取40μl反应产物,小心转移至数字96孔反应板中,170℃热封膜;
(4)pcr反应程序:94℃预变性热激活10min,1个循环;94℃变性30s,60℃退火1min,40个循环;98℃酶失活10min,1个循环;
(5)结果分析:微滴数字pcr仪自动计算每个反应的拷贝数浓度、总微滴数和阳性微滴数,总微滴数大于10000以上视为有效结果,按照公式a=b/c,计算出试样中耐除草剂转基因大豆zh10-6的外源目的基因在基因组插入的拷贝数;公式中a为耐除草剂转基因大豆zh10-6的外源目的基因在基因组插入的拷贝数,b为耐除草剂转基因大豆zh10-6外源目的基因的拷贝数浓度,c为内参基因lectin基因的拷贝数浓度。
3.权利要求1所述的耐除草剂转基因大豆zh10-6的特异性引物及探针再用于微滴数字pcr快速高效分析转基因大豆zh10-6拷贝数方面的应用。