一种微滴数字PCR分析耐除草剂转基因大豆ZH10-6拷贝数的方法

文档序号:24557172发布日期:2021-04-06 12:07阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种用于检测转基因大豆zh10-6的特异性引物及探针,其特征在于包括g2epsps外源插入目的基因序列:

正向引物序列:5’-tcgagattgatggtggtttgtc-3’

反向引物序列:5’-tcagcgccacttcaatcg-3’

探针序列:fam-ccagtacgtatcggccctgctgatg-bhq1;

gat外源插入目的基因序列:

正向引物序列:5’-gggcaaactgatttccatagctt-3’

反向引物序列:5’-cctcggagctggtactgtttct-3’

探针序列:fam-attccaccaggccgagcactcaga-bhq1;

3’端转化体特异性序列:

正向引物序列:5’-accttcggttccacccttgt-3’

反向引物序列:5’-aggaacaaaaggaaacaaaaaataat-3’

探针序列:fam-tagtttccgaggcagacacatcagtt-bhq1;

内源基因lectin基因序列:

正向引物序列:5’-gccctctactccaccccca-3’

反向引物序列:5’-gcccatctgcaagccttttt-3’

探针序列:fam-agcttcgccgcttccttcaacttcac-bhq1。

2.一种采用权利要求1所述用于检测转基因大豆zh10-6的特异性引物及探针精准定量检测转基因耐除草剂大豆zh10-6的方法,其特征在于如下步骤:

(1)g2epsps外源插入目的基因序列:

正向引物序列:5’-tcgagattgatggtggtttgtc-3’

反向引物序列:5’-tcagcgccacttcaatcg-3’

探针序列:fam-ccagtacgtatcggccctgctgatg-bhq1;

gat外源插入目的基因序列:

正向引物序列:5’-gggcaaactgatttccatagctt-3’

反向引物序列:5’-cctcggagctggtactgtttct-3’

探针序列:fam-attccaccaggccgagcactcaga-bhq1;

3’端转化体特异性序列:

正向引物序列:5’-accttcggttccacccttgt-3’

反向引物序列:5’-aggaacaaaaggaaacaaaaaataat-3’

探针序列:fam-tagtttccgaggcagacacatcagtt-bhq1;

内参基因lectin基因序列:

正向引物序列:5’-gccctctactccaccccca-3’,

反向引物序列:5’-gcccatctgcaagccttttt-3’,

探针序列:fam-agcttcgccgcttccttcaacttcac-bhq1;

(2)pcr反应体系:总体积为20μl,包括bio-radddpcrsupermixforprobes10μl,10µmol/l上游引物1μl,10µmol/l下游引物1μl,10µmol/l探针1μl,25ng/μldna模板1μl,最终用无菌水补充至20μl;

(3)微滴生成:将20μl反应体系小心转移至微卡发生器,避免产生气泡,同时与微卡发生器相应位置加入微滴生成油70μl,盖上垫片,放入微滴生成器中生成微滴,微滴生成后用移液器倾斜30-45度吸取40μl反应产物,小心转移至数字96孔反应板中,170℃热封膜;

(4)pcr反应程序:94℃预变性热激活10min,1个循环;94℃变性30s,60℃退火1min,40个循环;98℃酶失活10min,1个循环;

(5)结果分析:微滴数字pcr仪自动计算每个反应的拷贝数浓度、总微滴数和阳性微滴数,总微滴数大于10000以上视为有效结果,按照公式a=b/c,计算出试样中耐除草剂转基因大豆zh10-6的外源目的基因在基因组插入的拷贝数;公式中a为耐除草剂转基因大豆zh10-6的外源目的基因在基因组插入的拷贝数,b为耐除草剂转基因大豆zh10-6外源目的基因的拷贝数浓度,c为内参基因lectin基因的拷贝数浓度。

3.权利要求1所述的耐除草剂转基因大豆zh10-6的特异性引物及探针再用于微滴数字pcr快速高效分析转基因大豆zh10-6拷贝数方面的应用。


技术总结
本发明公开了一种微滴数字PCR分析耐除草剂转基因大豆ZH10‑6拷贝数的方法,该方法以耐除草剂转基因大豆ZH10‑6的G2EPSPS和GAT外源插入目的基因序列、3’端转化体特异性序列设计合成特异性引物和探针,结合大豆内标基因Lectin,构建微滴数字PCR反应体系。微滴数字PCR是采用一对特异性的引物、带有荧光标记的探针及一种具有链置换活性的DNA聚合酶,在PCR反应前由微滴发生器将PCR体系分配到足够小的反应单元中,实现每个反应单元只有单个模板分子,在60℃左右对核酸进行PCR扩增,再采用泊松分布原理,根据阳性微滴与阴性微滴数的比例计算目标分子拷贝数,实现绝对定量分析,无需标准品,无需构建标准曲线。其结果鉴定通过微滴读取器读取阳性微滴以及阴性微滴的个数,并以外源基因与内标准基因拷贝数浓度的比值计算样品的转基因含量和转化体拷贝数。本发明的检测方法具有精准定量、高特异性、高灵敏度、快速、简便等优点。

技术研发人员:王勃;郭勇;赵新;邱丽娟;刘双;袁珊;王成;兰青阔;王永
受保护的技术使用者:天津市农业科学院;中国农业科学院作物科学研究所
技术研发日:2020.12.24
技术公布日:2021.04.06
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