一种同步检测多种生殖道感染相关的病原体的引物组、探针组及试剂盒的制作方法

[0001]
本发明涉及核酸扩增技术领域，具体涉及一种同步检测多种生殖道感染相关的病原体的引物组合物及其试剂盒。


背景技术：

[0002]
近年来泌尿生殖道感染疾病患者不断增多，已婚妇女常见流行病学调查研究显示此类感染患病率已成为妇科疾病之首。引起生殖道感染的病原体种类繁多、复杂，并且存在一定的无症状感染，给疾病的诊治造成诸多困难。生殖道病原体感染通常会导致以下病症：泌尿系统感染、阴道炎、盆腔炎等。生殖道病原体感染会增加男女不孕症、孕产妇的异位妊娠、流产、早产等病症的发生率；淋病、梅毒等感染可传给子女，影响出生婴儿的身体素质和下一代的健康；生殖系统的慢性炎症将增加hiv感染几率。
[0003]
生殖道感染会对人的生殖功能造成损害，是造成众多患者不孕不育的一项重要原因。20%-60%的女性不孕中，是由生殖道病原体感染所引起的。阴道炎是极为常见的一种妇科疾病，居妇女生殖道感染疾病之首，其发生、发展往往是多种因素共同作用的结果。生殖道病原体复杂多样，包括细菌、霉菌、滴虫、支原体、衣原体、淋球菌、病毒等，所引起的生殖道感染与阴道炎的发生、发展密切相关。由沙眼衣原体、淋病奈瑟氏菌、人型支原体、生殖支原体、解脲脲原体、乳头瘤病毒等引发的性传播疾病也可以对器官正常功能造成影响，诱发不孕症。此外，15%左右男性出现不育也是因为生殖道感染，男性生殖道感染将引发生殖器的一系列炎症，从而对精子的发生、成熟和转运产生严重影响。
[0004]
近年来，生殖道感染导致的不孕不育形势严峻，发病率逐年增高，对家庭的幸福与社会的和谐均造成了非常严重的不良影响。加强对患者生殖道感染的检测，将对临床诊断和治疗有着重大的意义。
[0005]
临床上引起生殖道感染的病原体复杂、多样，诊断困难，迫切需要寻求一种特异性强、敏感性高，同时快速、经济的针对多重病原学的检测手段，为临床病原学的诊治提供实验依据。
[0006]
目前，临床上生殖道感染病原体检测方法主要有病原体培养法、免疫法和荧光定量pcr法等。病毒培养检测法具有特异性高的特点，是临床诊断的“金标准”，但培养耗时、敏感性低、对实验操作要求高；细菌培养可以检测耐药情况，但样本易污染，对结果影响较大；生殖道感染病原体免疫学检测法常采用酶联免疫吸附试验，该法具有直观、技术成熟、特异性好的优点，但耗时、操作繁琐、灵敏度低、假阳性高等限制了其在临床上的参考价值；荧光定量pcr技术具有敏感性高、检测快速、成本相对低等优点，已在临床诊断中得到广泛应用。
[0007]
但染料法荧光定量pcr特异性相对较差，且不能对不同目标产物进行分别定量，多重荧光定量pcr是在其基础上发展的多重联检，弥补了这些不足，实现了在同一反应管中同时对多个基因序列的扩增和特异性检测。多重荧光定量pcr可以同时检测同一标本内几十种甚至上百种关联病原体，有利于精确判断病情，实现疾病的早期、快速、精准治疗。要成功
实施多重pcr需要解决以下几个技术问题：（1）需要确定与生殖道感染相关的病原体组合，该组合可以诊断涵盖当前临床95%以上生殖道感染相关的病原体；（2）由于需要使用多组引物/探针组合，设计时需要避免不同引物/探针之间互相产生交联；（3）避免每组引物/探针对其他目标和非目标核酸序列有交叉同源性，防止产生假阳性结果；（4）每种扩增子的最佳扩增条件不同，需要优化反应条件，保证在单一扩增条件下各扩增子都能成功扩增；（5）需要有内对照作为参考以排除来自核酸提取等方面的干扰。


技术实现要素：

[0008]
本发明的首要目的是针对上述技术问题，根据统计学研究，提出一种用于生殖道感染相关的病原体标志物的组合。
[0009]
本发明的第二个目的是提供上述病原体标志物的引物。
[0010]
本发明的第三个目的是提供上述标志物及其引物的组合在制备生殖道感染病原体诊断或辅助诊断试剂盒中的应用。
[0011]
本发明提供的病原体标志物及其引物在制备用于诊断生殖道感染的产品中的应用，可以缓解现有技术中存在的对生殖道感染相关的特定病原体诊断研究尚有不足的技术问题。
[0012]
本发明的第四个目的是提供生殖道感染的诊断或辅助诊断的试剂盒。以缓解现有技术中存在的对生殖道感染相关病原体标志物的检测特异性不强的技术问题。
[0013]
一种同步检测多种生殖道感染相关的病原体的引物组合物，包括所述病原体单纯疱疹病毒1型（hsv1）的上游引物具有如seqidno.1所示的核苷酸序列，下游引物具有如seqidno.2所示的核苷酸序列，具有如seqidno.3所示的核苷酸序列的单纯疱疹病毒1型探针；病原体单纯疱疹病毒2型（hsv2）的上游引物具有如seqidno.4所示的核苷酸序列，下游引物具有如seqidno.5所示的核苷酸序列，具有如seqidno.6所示的核苷酸序列的单纯疱疹病毒2型探针；病原体b族链球菌（sag）的上游引物具有如seqidno.7所示的核苷酸序列，下游引物具有如seqidno.8所示的核苷酸序列，具有如seqidno.9所示的核苷酸序列的b族链球菌探针；病原体阿托波氏菌（av）的上游引物具有如seqidno.10所示的核苷酸序列，下游引物具有如seqidno.11所示的核苷酸序列，具有如seqidno.12所示的核苷酸序列的阿托波氏菌探针；病原体普雷沃菌（pv）的上游引物具有如seqidno.13所示的核苷酸序列，下游引物具有如seqidno.14所示的核苷酸序列，具有如seqidno.15所示的核苷酸序列的普雷沃菌探针；病原体巨球形菌（me）的上游引物具有如seqidno.16所示的核苷酸序列，下游引物具有如seqidno.17所示的核苷酸序列，具有如seqidno.18所示的核苷酸序列的巨球形菌探针；病原体动湾杆菌（mb）的上游引物具有如seqidno.19所示的核苷酸序列，下游引物具有如seqidno.20所示的核苷酸序列，具有如seqidno.21所示的核苷酸序列的动湾杆菌探针；病原体淋病奈瑟菌（ng）的上游引物具有如seqidno.22所示的核苷酸序列，下游引物具有如seqidno.23所示的核苷酸序列，具有如seqidno.24所示的核苷酸序列的淋病奈瑟菌探针；
病原体加德纳菌（gv）的上游引物具有如seqidno.25所示的核苷酸序列，下游引物具有如seqidno.26所示的核苷酸序列，具有如seqidno.27所示的核苷酸序列的加德纳菌探针；病原体阴道毛滴虫（tv）的上游引物具有如seqidno.28所示的核苷酸序列，下游引物具有如seqidno.29所示的核苷酸序列，具有如seqidno.30所示的核苷酸序列的阴道毛滴虫探针；病原体梅毒螺旋体（tp）的上游引物具有如seqidno.31所示的核苷酸序列，下游引物具有如seqidno.32所示的核苷酸序列，具有如seqidno.33所示的核苷酸序列的梅毒螺旋体探针；病原体白色念珠菌（ca）的上游引物具有如seqidno.34所示的核苷酸序列，下游引物具有如seqidno.35所示的核苷酸序列，具有如seqidno.36所示的核苷酸序列的白色念珠菌探针；病原体解脲脲原体（uu)的上游引物具有如seqidno.37所示的核苷酸序列，下游引物具有如seqidno.38所示的核苷酸序列，具有如seqidno.39所示的核苷酸序列的解脲脲原体探针；病原体沙眼衣原体（ct）的上游引物具有如seqidno.40所示的核苷酸序列，下游引物具有如seqidno.41所示的核苷酸序列，具有如seqidno.42所示的核苷酸序列的沙眼衣原体探针；病原体人型支原体（mh）的上游引物具有如seqidno.43所示的核苷酸序列，下游引物具有如seqidno.44所示的核苷酸序列，具有如seqidno.45所示的核苷酸序列的人型支原体探针。
[0014]
其中，所述单纯疱疹病毒1型探针的5’端标记有fam发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团bhq1；所述单纯疱疹病毒2型探针的5’端标记有fam发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团bhq1；b族链球菌探针的5’端标记有rox发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团bhq2；所述阿托波氏菌探针的5’端标记有rox发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团bhq2；所述普雷沃菌探针的5’端标记有hex发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团bhq1；所述巨球形菌探针的5’端标记有fam发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团bhq1；所述动湾杆菌探针的5’端标记有hex发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团bhq1；所述淋病奈瑟菌探针的5’端标记有rox发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团bhq2；所述加德纳菌探针的5’端标记有hex发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团bhq1；所述阴道毛滴虫探针的5’端标记有fam发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团bhq1；所述梅毒螺旋体探针的5’端标记有fam发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团bhq1；所述白色念珠菌探针的5’端标记有rox发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团bhq2；所述解脲脲原体探针的5’端标记有rox发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团bhq2；所述沙眼衣原体探针的5’端标记有hex发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团bhq1；所述人型支原体探针的5’端标记有hex发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团bhq1。
[0015]
一种检测多种生殖道感染相关的病原体的试剂盒，包括权利要求1所述的15中病原体的上游引物、下游引物及探针、病原体标志物标准品、逆转录酶、缓冲液、dntps、mgcl2、depc水和taq酶。
[0016]
进一步地，各引物在多重荧光定量pcr反应体系中的终浓度为0.12μm，各探针在反应体系中的终浓度为0.052μm。
[0017]
进一步地，所述的试剂盒的检测样本为宫颈阴道分泌物、尿液。
[0018]
进一步地，所述病原体标志物的标准品的浓度为10
13
copy/μl。
[0019]
进一步地，病原体标志物为：单纯疱疹病毒1型（hsv1）、单纯疱疹病毒2型（hsv2）、b族链球菌（sag）、阿托波氏菌（av）、普雷沃菌（pv）、巨球形菌（me）、动湾杆菌（mb）、淋病奈瑟菌（ng）、加德纳菌（gv）、阴道毛滴虫（tv）、梅毒螺旋体（tp）、白色念珠菌（ca）、解脲脲原体（uu)、沙眼衣原体（ct）、人型支原体（mh）。
[0020]
本发明的有益效果：本发明提供的病原体标志物组合通过实验发现在患有生殖道感染的宫颈阴道分泌物、尿液中表达量显著，因此本发明中提供的病原体标志物组合可以作为标志物用于生殖道感染的风险预估与检测，具有灵敏度高、准确性强的优点，为生殖道感染诊断提供了一定的应用价值，为生殖道感染的预防提供了有利支持，对我国生殖道感染的筛查及治疗有较大的帮助。另外，本发明还提供了用于诊断生殖道感染的试剂盒，包括检测病原体标志物的pcr上下游引物的组合、病原体标志物标准品及mrna两步法检测体系。其逆转录效率高，引物特异性强，灵敏度高，检测全面、快速、准确，应用广泛，检测结果可用于临床诊断和治疗。
附图说明
[0021]
图1示出了实施例2中7份阳性参考品的单纯疱疹病毒1型、b族链球菌、动湾杆菌的扩增曲线。
[0022]
图2示出了实施例2中7份阳性参考品的单纯疱疹病毒2型、阿托波氏菌、普雷沃菌的扩增曲线。
[0023]
图3示出了实施例2中7份阳性参考品的巨球形菌、淋病奈瑟菌、加德纳菌的扩增曲线。
[0024]
图4示出了实施例2中7份阳性参考品的阴道毛滴虫、白色念珠菌、人型支原体的扩增曲线。
[0025]
图5示出了实施例2中7份阳性参考品的梅毒螺旋体、解脲脲原体、沙眼衣原体的扩增曲线。
[0026]
图6示出了7份阴性参考品的扩增曲线。
具体实施方式
[0027]
下面详细描述本发明的实施例，在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，所述实施例的示例旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0028]
现结合附图和具体实施方式对本发明进一步说明。
[0029]
实施例1：制备用于15种生殖道病原体检测的多重荧光定量pcr试剂盒本发明用于15种生殖道病原体检测的多重荧光定量pcr扩增试剂盒，pcr扩增试剂盒的组成见表1。
[0030]
表1 pcr扩增试剂盒组成列表
本发明的试剂盒可用于检测15种生殖道病原体：单纯疱疹病毒1型（hsv1）、单纯疱疹病毒2型（hsv2）、b族链球菌（sag）、阿托波氏菌（av）、普雷沃菌（pv）、巨球形菌（me）、动湾杆菌（mb）、淋病奈瑟菌（ng）、加德纳菌（gv）、阴道毛滴虫（tv）、梅毒螺旋体（tp）、白色念珠菌（ca）、解脲脲原体（uu)、沙眼衣原体（ct）、人型支原体（mh）核酸。
[0031]
本发明15种生殖道病原体引物和探针的设计：选用15种生殖道病原体相对应的保守区作为本发明试剂盒的目标基因，针对每种病原体分别设计了2对引物及相对应的探针。并根据实验结果，综合考虑检出率、扩增线型、扩增效率等方面，每个型别选取一个引物组合。15种生殖道病原体的引物、探针序列见说明书核苷酸和氨基酸序列表。
[0032]
将15种生殖道病原体分成5组，分别标记为rvd15扩增液1#-5#，进行多重pcr。具体组合见表3。
[0033]
表2 15种生殖道病原体（rvd15扩增液1#-5#）分组列表
本发明内标引物探针的设计：本发明引入管家基因β-actin作为内标，内标的引物、探针序列见表4。
[0034]
表3内标的引物、探针序列表优化多重荧光定量pcr体系：为了能最大限度提高了实验的可靠性和精密性，得到阳性符合率高的实验结果，本发明对基因扩增系统和酶混合液的主要成分进行了优化。
[0035]
本实施例1的基因扩增系统的各成分组成见表4-表9。
[0036]
表4 酶混合液组成列表表5 rvd15扩增液1#组成列表
表6 rvd2扩增液2#组成列表表7 rvd15扩增液3#组成列表
表8 rvd15扩增液4#组成列表表9 rvd15扩增液5#组成列表
本发明rvd15扩增液1#-5#的核酸扩增反应条件经优化后，确定为：设置循环条件：全过程105℃热盖；55℃15分钟，95℃30秒；进入以下循环：95℃10秒，60℃荧光读取30秒，40循环实施例2：多重荧光定量pcr试剂盒的检测方法1．检测试剂盒实施例1所制备用于15种生殖道病原体检测的多重荧光定量pcr试剂盒。
[0037]
检测对象2.1含管家基因的内标颗粒生理盐水（以下简称“内标生理盐水”）的配制：在洁净工作区对照品配制间，量取生理盐水（0.9%氯化钠溶液）800ml至1000ml容量瓶中，加入5.0
×
109copies/ml的病原体质粒或颗粒1ml，用生理盐水定容到1000ml，翻转使之充分混匀，使终浓度为5.0
×
106copies/ml。将上述溶液移到1000ml烧杯中，分装备用。
[0038]
2.2待测样本阴性7份收集hpv16型、hpv18型、hpv51型、纤毛菌、格式乳杆菌、詹氏乳杆菌、惰性乳杆菌等宫颈阴道分泌物样本，按165μl/支分装到离心管中，依次标记为n1、n2、n3、n4、n5、n6。
[0039]
2.3待测样本阳性7份临床收集单纯疱疹病毒1型（hsv1）、单纯疱疹病毒2型（hsv2）、b族链球菌（sag）、阿托波氏菌（av）、普雷沃菌（pv）、巨球形菌（me）、动湾杆菌（mb）、淋病奈瑟菌（ng）、加德纳菌（gv）、阴道毛滴虫（tv）、梅毒螺旋体（tp）、白色念珠菌（ca）、解脲脲原体（uu)、沙眼衣原体（ct）、人型支原体（mh）（15种病原体标本）质粒（dna病毒）或假病毒颗粒（rna病毒）各1份，浓度分别为5.0
×
103copies/ml。
[0040]
2.4最低检测限参考品8支取5个1000ml容量瓶，分别量取内标生理盐水800ml至该5个1000ml的容量瓶中，并按表15的组合分别加入15种相应浓度为5.0
×
107copies/ml的rvd15（15种病原体标本）质粒（dna病毒）或假病毒颗粒（rna病毒）各10μl，用内标生理盐水定容到1000ml，翻转使之充分混匀，即为最低检测限参考品。
[0041]
将上述溶液移到1000ml烧杯中，分装备用，编号m1-m5。要求一次实验检测10次必须全部检出。
[0042]
表10 最低检测限参考品分装2.5rvd15（15种生殖道病原体）精密性参考品5支在洁净工作区对照品配制间，取5个100ml容量瓶，分别量取内标生理盐水80ml至该5个100ml容量瓶中，并按表11的组合分别加入15种相应5.0
×
107copies/ml的rvdⅰ质粒（dna病毒）或假病毒颗粒（rna病毒）各10μl，用内标生理盐水定容到100ml，翻转使之充分混匀。
[0043]
将上述溶液移到100ml烧杯中，分装备用，编号r1-r5。
[0044]
表11 精密性参考品分装3.实验说明：3.1适用仪器abi7500、thermofisher-quantstudio3、thermofisher-quantstudio5、anadas9850全自动核酸提纯及扩增分析系统。
[0045]
3.2样本要求适用标本类型：宫颈阴道分泌物、尿液。
[0046]
宫颈阴道分泌物标本采集方法：标本采集前24h内禁止性交、盆浴、阴道灌洗和局部上药等；一般用消毒棉拭子自阴道深部或阴道穹隆后部、宫颈管口等处取材。
[0047]
尿样本采集：清洁标本采集部位；避免月经、阴道分泌物、粪便、清洁剂等各种物质的污染；使用合格容器，细菌培养的标本，应使用消毒培养瓶或无菌、有盖的容器；清洁尿包括中段、导尿标本或耻骨上穿刺尿。
[0048]
样本保存：待测分泌物拭子在2-8℃保存，保存期不应超过72小时；在-20℃
±
5℃保存期半年，-70℃以下长期保存；冷藏样本检测前应恢复至室温，样本应尽量避免反复冻融；标本一经采集，应尽可能快的送至检测实验室。
[0049]
3.3 检验方法3.3.1样本前处理：将采样管置于涡旋混匀仪上充分涡旋10秒，以洗下拭子上黏附的病原体及含有病原体的细胞等。
[0050]
3.3.2推荐核酸提取设备为bnp32（山东博科科学仪器有限公司，鲁济械备20200076号），试剂为磁珠法核酸提取试剂盒（山东博科科学仪器有限公司，鲁济械备20200245号）
3.3.3试剂准备（试剂准备区）：1）取出试剂盒中的rvdⅰ1-5号管和酶混合液室温放置，使其充分溶解，混匀后备用。
[0051]
2）pcr反应混合液配制：按照rvdⅰ1-5号管反应液21.5μl/人份+酶混合液1.5μl/人份的比例混合，混合均匀后3000~5000g离心5秒，移至标本处理区。
[0052]
3.3.4标本处理（标本处理区）：取200μl标本放入bnp32核酸提取试剂盒，按照说明书进行操作。阴阳性对照直接抽取50μl备用。
[0053]
3.3.5加样（标本处理区）：pcr反应管中分别加入23μl的rvdⅰ1-5号管pcr反应混合液，然后分别加入标本处理步骤制备的核酸7μl，稍微离心，置入荧光pcr扩增仪内。
[0054]
3.3.6上机检测（扩增检测区）：1）循环条件设置：全过程105℃热盖；55℃15分钟，95℃30秒；进入以下循环：95℃10秒，60℃荧光读取30秒，40循环。
[0055]
2）仪器检测通道选择：荧光素设定为fam、hex/vic、rox、cy5，具体设置方法请参考仪器使用说明书。
[0056]
3.3.7结果分析条件设定使用全自动医用pcr分析系统进行分析时，基线取3-15个循环的荧光信号，阈值可以根据仪器噪音情况调整，设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线（无规则的噪音线）的最高点，且ct值=0为准。
[0057]
3.3.8检验结果的解释（1）阴性对照ct值=0，阳性对照所有病原体ct值≤35，管家基因ct值≤33，否则该次实验视为无效。若对照试验结果和管家基因结果有效，检验结果按下列解释报告。
[0058]
（2）若对照试验结果有效，检验结果按下列解释报告：八联管中的各个荧光通道有信号升起表示该标本感染对应分型，具体对应情况参考表12的荧光通道对应病原体列表。
[0059]
表12荧光通道对应病原体列表
（3）如果检测样本ct值在38≤ct＜40范围内，样本重检；如果重检结果样本ct≤38.0，判断为阳性，报告阳性；如果重检检测样本ct值=0或＞38，判断为阴性，报告阴性。
[0060]
（4）针对检出阳性的病原体，以管家基因为相对定量基准，ct值为20时约为5
×
105copies/ml。
[0061]
检测结果4.1实验数据分析4.1.1参照图1-5，阳性参考品7份均为阳性，均有扩增曲线；参照图6，阴性参考品7份均为阴性，均无扩增曲线。图1-6的结果表明，本发明的试剂盒检测结果具有特异性。
[0062]
尽管结合优选实施方案具体展示和介绍了本发明，但所属领域的技术人员应该明白，在不脱离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围内，在形式上和细节上可以对本发明做出各种变化，均为本发明的保护范围。