具有核苷类似物的寡核苷酸的制作方法

具有核苷类似物的寡核苷酸
1.本技术要求以下美国临时申请的优先权：2019年10月2日提交的62/909526；2019年10月29日提交的62/927500；以及2020年2月17日提交的62/977,630，其各自的内容通过引用整体并入本文。


背景技术：

2.sirna是由有义链和互补反义链组成的双链rna分子。这些分子可能是每条链上19-29个碱基长的平末端分子，或者它们可能表现出两个碱基突出(通常为dtdt)。
3.sirna的每条链通常在合成仪上通过以下制备：将所需序列中的下一个碱基偶联至前一个的与增长中的寡核苷酸相连的碱基。亚酰胺化学或其他合成方法在本领域中是众所周知的。当合成完成时，之后两条链彼此退火以形成双链体。
4.已经证明，针对癌细胞内选定靶标的sirna可以能够降低由被沉默的基因靶标所编码的蛋白的表达。因此，沉默这些基因可以抑制该细胞的生长。如果细胞具体地是sirna可以接近(access)的疾病细胞(例如，癌细胞)，那么sirna可以作为治疗剂发挥作用。此外，在某些情况下，已经发现，可以通过沉默选择的通路中的基因来增强目前作为治疗“金标准”的选择性疗法(小分子抑制剂、单克隆抗体等)的用途。
5.吉西他滨(2',2'-二氟2'-脱氧胞苷)是基于嘧啶的核苷类似物，其在全身施用时被核苷转运蛋白摄取，通过脱氧胞苷激酶进行三磷酸化而激活，之后可以掺入rna或dna中。其在dna复制期间(细胞分裂期间)取代核酸胞嘧啶从而可以抑制肿瘤生长，因为新的核苷不能连接到这种核苷模拟物上从而导致细胞凋亡(damaraju等人，oncogene 22：7524
–
7536(2003))。
6.吉西他滨是治疗胰腺癌的主要治疗剂(burris等人，j clin oncol 15：2403
–
2413(1997))，但也用于治疗许多其他癌症，包括胆管癌(jo和song，“chemotherapy of cholangiocarcinoma：current management and future directions.topics in the surgery of the biliary tree”，第三章；第35-52页。http：//dx.doi.org/10.5772/intechopen.76134,s.y.(2018))、非小细胞肺癌(muggia等人，expert opinion on investigational drugs，21：4，403-408(2012))、卵巢癌(le等人，gynaecol.oncol.res.pract.4：16(2017)和乳腺癌(xie等人，oncotarget，9：7148-7161(2018))。吉西他滨被核苷转运蛋白摄取，通过脱氧胞苷激酶激活，之后掺入rna和dna中。抑制核糖核苷酸还原酶和dcmp脱氨酶增强其活化，而胞苷脱氨酶将吉西他滨转化为其可能无活性的代谢物2',2'-二氟脱氧尿苷，其可以核苷酸形式抑制胸苷酸合酶。吉西他滨通过静脉输注全身施用到患者体内。吉西他滨的标准施用方式是以1000mg/m2每周输注30分钟，但其效用受到限制，因为其不仅分布于肿瘤细胞而且分布于正常细胞，因此具有显著的毒性。此外，为了在某些肿瘤类型中看到效能，需要将剂量提高到非常高的水平，并且药物的治疗指数可能非常有限。
7.吉西他滨广泛用于联合使用，主要与铂类似物联合使用。在卵巢癌中吉西他滨联合的其他替代方案包括使用triapine或羟基脲增加核糖核苷酸还原酶的抑制。
8.已经尝试了各种克服吉西他滨毒性的方法。最有希望的方法之一是使用靶向递送剂，其选择性地富集地递送至肿瘤细胞并且减少其向正常细胞的递送。
9.增强化合物吉西他滨作用的基因的示例包括靶向rad17、chk1、chk2、atr、atm的sirna，仅举几例(参见：azorsa，j.transl.med.7：43(2009)；fredebohm(journal of cell science 126：3380
–
3389，2013)和plunkett等人，semin oncol 23：3
–
15(1996))。
10.如上所述的研究试图找到在细胞内的其他靶标，当靶标被抑制(通过如小分子或抗体等拮抗剂)或被沉默(使用sirna或mirna)时，会导致针对药物的剂量反应曲线产生有益的移动，移向药物以更低剂量/浓度显示相同的效能。
11.使用针对rad17或chk1的sirna可以看到这种剂量反应的移动(如实施例所示)。
12.使用多种靶向或非靶向递送剂可以实现将这些sirna递送至表现出疾病的动物/人体内的肿瘤环境。这些递送载剂可以由脂质、修饰的脂质、肽递送载剂等组成，或者甚至可以通过修饰的骨架将靶向配体直接连接到修饰的(化学稳定的)sirna分子上以防止核酸酶和循环中遇到的其他酶降解sirna。
13.最近，galnac修饰的sirna已被用于促进这些sirna特异性递送至肝脏内的肝细胞。galnac部分以非常高的亲和力结合至肝细胞上特异性的和大量存在的去唾液酸糖蛋白受体(asgpr)。asgpr被认为在结合后被内化到细胞中，因此将连接的sirna携带到具有其的细胞中。
14.其他可以将有效负荷递送到特定细胞类型的靶向配体包括glp1肽(与胰腺β细胞上的glp1受体结合)、rgd基序(例如，结合α5β3整合蛋白受体的crgd、irgd或源自口蹄疫病毒的肽(与α5β6整合蛋白受体以nm的亲和力结合，相比之下，与α5β3受体以差不多微摩尔的亲和力结合)、叶酸配体(与叶酸受体结合)、与转铁蛋白受体结合的转铁蛋白配体以及靶向egf受体的egfr。许多其他靶向部分的示例显示了递送至不同细胞类型的特异性。
15.本文描述了组合物和方法，其提供共递送sirna(其将使基因沉默)与药物(例如，吉西他滨)，以产生比单独施用sirna或药物更大的治疗收益。
16.吉西他滨(如5-fu和其他核苷类似物)可以通过传统合成方式(手动或使用自动化仪器)以允许直接偶联dna或rna碱基的方式化学合成。
具体实施方式
17.提供了包含以吉西他滨(gem)取代sirna序列内的胞嘧啶部分的sirna组合物。提供了包含这些sirna分子的药物组合物，以及使用该组合物治疗疾病(例如癌症)的方法。
18.定义
19.小干扰rna(sirna)：其是短的双链rna的双链体寡核苷酸，在分子被引入细胞中后干扰该细胞中基因的表达。例如，其靶向并结合单链靶标rna分子中的互补核苷酸序列。通过本领域技术人员已知的技术经化学合成或以其他方式构建sirna分子。此类技术描述在美国专利号5,898,031、6,107,094、6,506,559、7,056,704、re46,873e和9,642,873b2以及欧洲专利号1214945和1230375，其全部通过引用其整体并入本文。按照本领域的惯例，当通过具体的核苷酸序列标识sirna分子时，该序列是指双链体分子的有义链。可以通过本领域已知的技术对组成该分子的一个或多个核糖核苷酸进行化学修饰。除了在其一个或多个的个体核苷酸的水平上修饰之外，也可以修饰寡核苷酸的主链。其他修饰包括使用小分子(例
如，糖分子)、氨基酸、肽、胆固醇和其他大分子偶联到sirna分子上。
20.microrna(mirna)：小的、非编码的rna分子，通过靶向和结合单链靶标rna分子中的互补核苷酸序列，在rna沉默和基因表达的转录后调节中发挥作用。
21.反义寡核苷酸(aso)：短的、单链rna或dna(通常为11-27个碱基)，其可通过靶向和结合单链靶标rna分子中的互补核苷酸序列来降低哺乳动物细胞内基因的表达。
22.dna或rna适体：与特定靶标分子结合的单链dna或rna寡核苷酸。此类靶标包括小分子、蛋白质和核酸。此类适体通常是通过重复几轮体外选择或通过指数富集(selex)对配体进行系统进化从大型随机序列池中创建的。
23.polygem序列：包含连续(in a row)多个的吉西他滨核苷的序列。
24.oligogem：具有多个吉西他滨核苷的寡核苷酸。核苷可以在寡核苷酸的任一末端或寡核苷酸内是连续的，或者核苷可以散布在寡核苷酸内，包括在一端或两端的单个核苷。
25.组氨酸-赖氨酸共聚物：由组氨酸和赖氨酸氨基酸组成的肽或多肽。此类共聚物描述在美国专利号7,070,807b2、7,163,695b2和7,772,201b2中，其通过引用其整体并入本文。
26.癌是任何恶性肿瘤。
27.恶性肿瘤是一团赘生细胞。
28.肝癌：肝脏内的任何原发性癌，即起源于肝脏中的癌；或肝脏内的任何继发性癌，即从哺乳动物体内另一组织转移至肝脏的癌。原发性肝癌的一个示例是肝细胞癌。继发性肝癌的一个示例是结肠癌。
29.治疗/治疗(treating/treatment)：杀伤一些或全部癌细胞，减小癌的大小，抑制癌的生长或降低癌的生长速率。
30.增强抗肿瘤效能：是指提供在肿瘤细胞生长速率上的更多降低，提供在杀伤肿瘤细胞和/或减少肿瘤质量上的更好效果，并最终通过延长肿瘤患者的寿命产生更好的治疗效果。
31.用于增强gem活性的靶标选择
32.含有gem的构建体
33.azorsa等人(j.transl.med.7：43(2009))鉴定了针对基因chk1的sirna，其显示吉西他滨在对培养物中的胰腺癌细胞的作用增强。随后，fredebohm(journal of cell science 126：3380
–
3389,2013)验证了chk1作为吉西他滨在胰腺肿瘤细胞中作用的增效剂，但也鉴定了其他几个潜在的靶标，其在被沉默时提高吉西他滨的活性。rad17被鉴定为是这些靶标之一，并显示显著提高吉西他滨在降低细胞活力方面的作用。
34.rad17被认为是比chk1更好的靶标，因为单独沉默该基因对细胞活力几乎没有影响，但是当包括吉西他滨时，降低癌细胞活力的协同作用也很明显。然而，即使没有吉西他滨的存在，chk1沉默本身被证明在细胞中表现出一些毒性—这需要使用针对chk1的sirna，其需要以优先摄取到肿瘤细胞中的方式施用，而不是进入正常分裂的细胞。
35.已经证明，rad17抑制也可以与检查点激酶的抑制协同作用(shen等人，oncotarget 6：35755-35769(2015))。因此，有可能针对两个靶标—rad17和chk1共同递送sirna，以进一步增强针对胰腺癌的活性。如本文所述，针对rad17和chk1的sirna都可以在有义链内用吉西他滨核苷酸修饰或将吉西他滨核苷酸修饰附加到有义链的末端，并且2种
gem修饰的sirna可以组合在单个多肽纳米颗粒中，从而提高转染细胞时的效能。此外，使用组氨酸-赖氨酸支化的共聚物制备的多肽纳米颗粒(“pnp”)可以同时将多个sirna附随地递送至同一细胞。这些pnp还可用于将sirna递送至多种在动物模型中作为异种移植物的肿瘤细胞类型。
36.如下所述，可以制备sirna分子，其含有与sirna序列的末端相连的和/或在序列内部的gem部分。这些含有gem的sirna仍然保留沉默靶标基因的功能，并通过将gem释放到细胞中产生增强的杀伤肿瘤效能，其中在基因沉默活性和药物作用间观察到协同效应，即所见的结果优于将sirna和gem作为分开的组分单独施用所实现的。
37.为了确定如果通过天然核苷酸分离，gem是否会得到更好的加工，我们利用了吉西他滨是核苷酸胞嘧啶类似物因此可以直接掺入sirna序列中取代胞嘧啶(c)的事实。吉西他滨亚酰胺化物可用于形成完全由gem部分组成的聚合物。(ma等人，chem.commun.，55：6603-6606(2019))。这些聚合物形成纳米凝胶，并且这些聚合物在体外和体内的癌细胞模型中表现出一定的活性。掺入酰胺化物(amidite)官能团的修饰核苷可用于在双链体的合成过程中向其中的一条链引入修饰的核苷，如gem。由于来自sirna双链体的反义链必须与sirna区域内有义链中的适当序列退火，并且反义链被掺入到risc复合物中并用于监视mrna序列匹配，因此首先将修饰的核苷附加到sirna的有义链以形成有义链相对于反义链的长度延伸。多个(n)非天然核苷碱基可以掺入在链的末端，使得单个sirna分子的递送导致多个(n)非天然核苷的共同递送。
38.一旦进入细胞质内，反义链就会被掺入risc复合物中，如果识别出匹配的mrna序列，则mrna会被dicer酶切割。在此过程中有义(sense)链被去掉然后在细胞质内被切割。然后，掺入至有义链末端的非天然核苷类似物将被内源性核酸酶切掉。然后，游离的吉西他滨分子(或与抗癌的非天然核苷类似物相类似的结构)抑制肿瘤细胞复制机制，并与sirna靶向的基因的表达降低相配合，在减少肿瘤细胞生长方面表现出比不使用这些药剂时更好的效果。
39.掺入gem残基的未经化学修饰的sirna分子可以在合适的纳米颗粒制剂中递送，以保护sirna免于在血液循环中或在组织、肿瘤微环境等中被降解。当进入肿瘤或目的组织中，sirna就会被释放到肿瘤细胞中以产生其细胞毒效应。
40.使用gem酰胺化物合成的sirna分子可以通过组氨酸赖氨酸多肽纳米颗粒(hkp pnp)纳米颗粒系统进行递送。gem可以包含在靶向基因的sirna双链体序列中，所述基因然后增强吉西他滨在杀伤肿瘤细胞中的作用—减少观察到治疗效果所需的施用量，并降低当吉西他滨单独施用至患者时所观察到的毒效应的可能性。如下所述，选择了先前公布的针对chk1的sirna序列(azorsa，见上文)，已证明了该sirna与吉西他滨分开施用时(即作为单独的组分)，对吉西他滨作用的增强作用。
41.可以使用本领域已知的方法，使sirna通过化学修饰(例如通过使用2
’‑
ome和/或2
’‑
f和/或硫代磷酸修饰)得到稳定，免于核酸酶降解。sirna可以任选地化学连接(通过ss或as的末端，或甚至通过添加到分子的末端gem)至靶向部分(例如，galnac、rgd、叶酸、tfr、egfr、肽靶向配体、适体或其他碳水化合物甚至小分子或抗体或纳米抗体)。靶向部分对细胞表面的受体或其他靶标具有亲和力，从而被富集地摄取到这些细胞中。如未修饰的sirna，ss和as链将在细胞中分开，as链将导致目的基因沉默，而释放的ss-polygem结构将
被降解从而释放出gem，其与被沉默的基因联合将表现出比单独使用更强的效果。
42.基本结构如图1所示。图2显示带有polygem尾部的反义寡核苷酸(“aso”)序列。图2b显示了通过靶向配体的靶向aso递送。图3显示了靶向寡核苷酸递送：图3a显示了连接到有义链的靶向配体，而图3b显示了连接到反义链的靶向配体。
43.聚吉西他滨也可以偶联至具有等长有义链和反义链的单个寡核苷酸(见图4)。退火后，其会形成连接在双链rna的两条链之间的“聚吉西他滨环”。与两条链相比，单个寡核苷酸序列具有降低的制造成本，并且还具有提高产物稳定性的潜力，以及将通过每个sirna向细胞递送远远更多量的gem分子的能力，从而提高抗癌细胞的效能。此外，在某些情况下，只要短链上有足够的碱基可以与长链上的相关同源序列进行杂交，rna的两条链就没有必要是相同的长度(见图5)。在这些情况下，吉西他滨环在两条链之间可能不对称。
44.在另一个实施方案中，这些构建体通过连接靶向配体而被靶向递送至特定细胞类型，所述靶向配体以高亲和力结合在靶标，所述靶标在靶标细胞上相较于在非靶标细胞上以更高水平存在。对于靶向递送，可以将多个配体连接到吉西他滨环区(见图6)—通过多个配体同时与其靶标结合来提供多价靶向的优势(增加结合的亲合力(avidity)并可能提高细胞特异性)。靶向配体通过接头偶联至环区中的吉西他滨。这可以将寡核苷酸和吉西他滨偶联物特异性地递送至靶细胞或组织，在其中偶联物可以诱导相加的或协同的或更广泛的治疗效果。配体也可以添加到不对称链构建体中的gem环中(图7)。
45.含有gem部分的chk1 sirna分子的具体示例如下所示。在没有gem的情况下，ss和as链退火形成靶向chk1的sirna。该特异性序列被设计为在人和小鼠chk1基因之间具有同一性，并且如下所述，其相较于chk1_az序列在沉默基因上更有效(参见图8和图9)。
46.ss＝5
’‑
ccu gug gaa uag ua[gem]uua[gem]ug[gem]aa u-3’([gem]取代了“c”)
[0047]
as＝5
’‑
a uug cag uaa gua cua uuc cac agg-3’(as链上没有gem)
[0048]
在其他分子中，添加的gem连接在ss的末端：
[0049]
ss＝5
’‑
ccu gug gaa uag ua[gem]uua[gem]ug[gem]aa u-[gem][gem]
…
[gem}3’([gem]取代“c”并且gem添加在3’末端)
[0050]
as＝5
’‑
a uug cag uaa gua cua uuc cac agg-3’(as链上没有gem)
[0051]
由于吉西他滨是胞嘧啶类似物，其可用于使用吉西他滨部分取代rna寡核苷酸序列中的胞嘧啶部分或dna寡核苷酸中的脱氧胞苷部分。这些gem仍将与寡核苷酸第二链上的对应物杂交，即gem将与相对链上的“g”(鸟苷/脱氧鸟苷)杂交。因此，通过包含取代sirna或mirna的有义链或反义链之一、或甚至在单链序列(如反义寡核苷酸(aso))中的胞嘧啶部分的gem部分，来增强靶向基因的sirna序列，所述基因当被沉默时产生对细胞生长的抑制并可以杀伤肿瘤细胞。如下所述，在沉默chk1基因的sirna的chk1_az序列中使用gem取代两个胞嘧啶部分，增强单独的sirna的抑制活性(参见下面的实验)。
[0052]
ss＝5
’‑
ccu gug gaa uag ua[gem]uua[gem]ug[gem]aa u-3’([gem]取代了“c”)
[0053]
as＝5
’‑
a uug cag uaa gua cua uuc cac agg-3’(as链上没有gem)
[0054]
gem添加也可以位于有义链的3'或5'末端。其也可以同样地添加到as链上。添加可以独立地包含1、2、3、4或更多个gem部分。
[0055]
其他核苷抗癌剂可以代替吉西他滨连接到寡核苷酸骨架上。此类类似物可包括阿糖胞苷(ara-c)、5-fu、5-脱氧-5-氟尿苷、氟达拉滨、卡培他滨、克拉屈滨、曲沙他滨或氯法
拉滨、氮杂胞苷和5-脱氧氮杂胞苷，仅举例若干(参见damaraju，同上)。
[0056]
许多sirna序列可以连接到有义链或反义链上的多核苷类似物链上。这种sirna序列的示例是沉默编码蛋白的基因的sirna，所述蛋白与核苷类似物的抑制机制起相反作用。例如，sirna可用于沉默负责吉西他滨脱氨基和失活的酶(胞苷脱氨酶或5'-核苷酸酶)或负责增强将核苷从细胞中释放的酶，例如：核苷转运蛋白(参见damaraju同上和其中的参考资料)。
[0057]
其他可用作这些构建体中的sirna序列(连接到核苷类似物链)的潜在靶标包括多药耐药(mdr)蛋白，例如，分别由mdr1和mrp1基因编码的p-糖蛋白(p-gp)和多药耐药相关蛋白-1(mrp1)。这些蛋白质的表达赋予对癌症化疗中使用的广谱药物的抗性表型。这些转运蛋白被广义上归类为atp结合表达盒蛋白(abc)并构成蛋白的超家族。已经描述了使用sirna沉默mdr1和mrp1基因。参见和g
ü
nd
ü
z，biomed pharmacother.65(2)：85-9(2011)。可以被沉默的基因的其他示例包括甲基转移酶、有机阴离子和阳离子转运蛋白(oat和oct)、氧化还原酶黄素蛋白和核苷转运蛋白(nt)，所有这些都参与细胞中的药物转运和代谢，并可能赋予癌细胞耐药表型。
[0058]
sirna的其他基因靶标是那些已被证实在当其自身被沉默时能增强吉西他滨或其他核苷类似物的作用的基因靶标。除chk1、rad17外，此类基因靶标还包括atr和wee1。由于其他靶标被沉默并被证明增强核苷活性，因此这些靶标也可以具有针对其的并与适当的核苷类似物偶联的sirna。
[0059]
在使用azorsa序列时，ss和as链上分别有2个c可以被取代。因此，我们制备了构建体，其中仅有ss通过掺入2个取代c的gem得到修饰，我们以相同的方式制备as链。然后，我们将包含2个gem的ss与未修饰的as链退火，并且我们将gem修饰的as链与未修饰的ss退火。我们进一步将gem修饰的ss与gem修饰的as链退火。将所有这些构建体与两条链均未修饰的sirna以及单独的吉西他滨的剂量反应进行比较。
[0060]
azorsa等人鉴定的sirna序列(chk1_az)是sirna的一个示例，可用于制备含有gem部分的分子。使用寡核苷酸合成仪，制造了以下sirna链，其中包含和不包含gem残基以取代序列中存在的天然胞嘧啶(“c”)基团。
[0061]
c1d-2a
–
(序列auugauacagaucucuuucuu)是指chk1 sirna反义(antisense)链，其包含2个取代胞嘧啶残基的gem残基并在3’末端具有dtdt；其与不包含任何gem的有义链(ss)(序列aagaaagagaucuguaucaau)退火。
[0062]
c1d-2s
–
指chk1 sirna有义链，其包含2个取代胞嘧啶的gem残基并在3’末端具有dtdt；其与不包含任何gem的反义链(as)退火。
[0063]
c1d-4
–
指包含2个gem残基的chk1 sirna反义链，其与也包含2个gem的有义链(ss)退火-即每个sirna4个gem。如上所述，两条链在3'末端都有dtdt。
[0064]
合成了这种sirna的类似物，其中2、4或6个gem附加在ss的3'末端，还设计了几种不同的sirna，其中序列中的c可以通过在其位置插入gem来修饰。在有义链和反义链中单独或组合插入取代c的gem，以探索增加gem含量是否提高效能或效价强度。将未修饰的chk1 sirna、c1d-2a、c1d-2s和c1d-4转染到已显示对chk1+gem敏感的胰腺癌细胞系bxpc3中(azorsa，同上)。进行吉西他滨单独与转染非沉默性的sirna的剂量反应以及(作为对照)。
[0065]
据观察，在ss的3'末端添加额外的gem(在通常的dtdt末端基团之前)没有比添加2
个gem更大的累加效应，并且当添加4个或6个时，效价强度和效能并没有增加。不受理论的束缚，怀疑存在于细胞内的核酸酶不能切割gem部分之间的polygem序列，只是仅可以从gem之前的未修饰的核苷酸上切割gem—无论序列中gem数量多少，仅从polygem序列内释放1个gem。因此，在ss的3'末端具有4或6个gem的构建体相较于在该位置有2个gem的构建体，具有相同或稍差的效价强度。
[0066]
与孵育同样时间的未修饰sirna(ic
50
＝3nm；图5右图)相比，在ss中插入gem取代c导致产物具有提高的ic
50
和效能(ic
50
＝0.38nm(图6))。在反义链中添加gem取代c残基可能会干扰sirna加载到risc复合物中或随后同源mrna的识别和之后被dicer切割。然而，通过选择特定的chk1 sirna序列，发现将gem添加到as链中提高了效价强度(potency)和效能(efficacy)(ic
50
1.8nm)，但没有达到ss观察到的程度。此外，组合2条链(现在共计包含4个gem)并没有进一步提高效价强度(1.98nm)，如果主要贡献来自两条链中gem的释放，则可预期的是进一步提高效价强度。该ic
50
与仅在as链中有2个gem相似。众所周知，在将sirna加载到risc复合物中的过程中，两条链被分离，有义链被释放到细胞质中，在那里其被降解。as链在risc中保留了一段时间，因此可能不会向混合物中贡献gem—因此所有gem都来自ss。
[0067]
这也在对由各种构建体诱导的沉默进行的qpcr分析中得到证实。图4显示，无论ss、as链或两条链上的gem数量如何，都获得了等同的sirna的基因沉默。
[0068]
当sirna在细胞内被加工时，反义链从有义链上解开并加载到risc复合物中，在那里其监视细胞的同源mrna序列。当mrna被反义链识别并结合时，mrna就会被酶dicer切割，反义链被加载到risc中，有义链被释放到细胞质中并被降解。在之前的出版物(ma等人，2019年)中，合成了由10个吉西他滨的重复序列组成的聚吉西他滨纳米凝胶，这些结构自退火形成纳米凝胶，然后在胰腺肿瘤细胞中显示出提高的效能。在有义链末端添加gem的重复序列，有望在将sirna递送至细胞的同时，产生相似的递送吉西他滨中的提高。然而，发现在有义链的[3']末端添加2、4或6个gem，之后与未修饰的反义链退火，不会产生预期的效价强度增加。相反，有2、4和6个gem序列仅显示出相同的效价强度，好像从每个序列释放1个gem。这可能是由于外切或内切核酸酶不能切割polygem序列，或者可能是由于非常缓慢的释放和之后磷酸化以激活gem。这些结构中的每一个在细胞活力实验中的效能结果显示，随着孵育时间的增加(从72小时到96小时)并没有提高。
[0069]
使用gem合成sirna
[0070]
chk-az sirna是19mer的sirna，在每条链的3'末端含有2个碱基(dtdt)突出。当在有义链中有包含吉西他滨部分的修饰时，我们将这些吉西他滨部分插入到有义链末端之间和dtdt末端基团之前。dtdt末端可能有助于稳定sirna序列以防止被核酸酶降解，而这又可能影响到as链监视待切割和沉默的同源的mrna序列的过程中，有义链与risc复合物中的as分离时gem从有义链上释放的速率。
[0071]
与含有gem的25mer相比，使用gem改进chk1_az的基本原理。
[0072]
我们设计的25mer的sirna是平末端sirna，而azorsa使用的sirna序列是在3’末端有2个碱基(dtdt)突出的19mer的sirna。当在sirna ss的最后一个核苷酸和dtdt突出之间添加2个gem部分时，我们看到该序列对miapaca细胞显示比对bxpc3细胞高得多的效能。当ss与as链解开并释放到细胞质中时，在序列末端包含dtdt可以降低gem从该构建体中的ss中释放的速率。这可能允许as序列在gem从ss释放之前诱导基因沉默，相较于bxpc3细胞，这
可能会增加这种组合在miapaca细胞中的效能。
[0073]
改进胰腺癌治疗的选择
[0074]
从所提供的数据看来，似乎我们可以通过加入吉西他滨来证明吉西他滨作用在胰腺癌细胞中的效能的显著提高。将多个gem掺入sirna的有义链可以将gem递送到sirna发挥作用的同一细胞中。在之前的研究中(azorsa，2009)表明沉默chk1可以增强吉西他滨的作用。因此，将gem添加到能够使chk1沉默的sirna序列中，我们预计相互作用中会有一些相加性/协同作用。使用组氨酸赖氨酸多肽纳米颗粒(pnp)，我们已经证明了将sirna递送至在体外和体内的许多不同肿瘤类型的能力。因此，我们正在研究将递送gem chk1 sirna作为一种新的治疗方式来治疗癌症。此外，多肽纳米颗粒能够同时将针对多于一个靶标的sirna递送至同一细胞，因此我们还可以沉默可与第一sirna协同作用的第二基因靶标。出版物(paul等人，2015)证明了chk1和rad17抑制之间在胰腺癌中的协同作用，因此可行的是我们可以从沉默rad17联合gem-chk1 sirna中受益。如果gem-chk1 sirna递送的吉西他滨量不足以在体外和/或体内产生强大的效果，那么我们可以进一步修饰rad17 ss以在该序列中引入gem取代“c”。
[0075]
吉西他滨选择
[0076]
可通过抑制核糖核苷酸还原酶和dcmp脱氨酶来增强吉西他滨的活性。
[0077]
吉西他滨被广泛联合使用，主要与铂类似物联合使用，其他组合不常使用或目前正在探索中。吉西他滨的标准施用方式是每周以1000mg/m2输注30分钟，但正在探索替代方案，例如前药(例如，co-1.01，其可以绕过转运缺陷)、固定剂量速率输注(10mg/m2/min)，以及通过24小时肝动脉输注、膀胱内滴注的局部施用途径、或腹膜内施用来治疗晚期卵巢癌。在卵巢癌中联合吉西他滨的其他替代方案包括使用triapine或羟基脲增加核糖核苷酸还原酶的抑制。吉西他滨对信号传导的作用也为与信号转导通路的联合提供了合理的理念。
[0078]
结论
[0079]
吉西他滨作为酰胺化物可以在寡核苷酸的合成过程中包含在内并掺入核苷酸序列中。我们已经证明，将gem添加到sirna可以使sirna和吉西他滨共同递送到同一细胞中。通过选择针对分子靶标的sirna，预计能提高吉西他滨在降低肿瘤细胞活力上的效果，我们可以看到效能的明显提高，这是单独使用每种试剂所看不到的。
[0080]
虽然我们选择使用靶向chk1和rad17的sirna作为示例，但吉西他滨可以掺入任何其他寡核苷酸中，并具有类似的结果。增强吉西他滨活性的sirna的示例也描述了将cmyc作为合适的基因靶标(zhang等人，cancer metastasis rev 26：85
–
110(2013))。因此，针对cmyc的sirna也可以直接掺入gem并用于治疗癌症，例如，nsclc。事实上，寡核苷酸可能根本不需要具有沉默作用，而是可以仅用于递送吉西他滨，以用于对抗疾病的效能。
[0081]
众所周知，对寡核苷酸sirna结构内的碱基进行化学修饰(例如，2'-ome、2'-氟、硫代磷酸酯修饰等)可以在体内施用时稳定寡核苷酸以防御核酸酶的攻击。可行的是，这种化学修饰的寡核苷酸可以直接与靶向配体偶联，从而可以通过与癌细胞上的受体结合直接递送。
[0082]
此外，反义寡核苷酸已被用于改变细胞内选定基因的表达，这些单链寡核苷酸也可以通过gem进行修饰。可以使用在序列末端的这些修饰(在c碱基处)或添加帮助改变与特定靶标的杂交效率以及改变与吉西他滨的共同递送。
[0083]
类似地，已经描述了具有抗癌作用的mirna(模拟物或抑制剂)，并且这些可以通过在其序列中插入吉西他滨来修饰，以便递送(do-delivery)至同一细胞。尤其是可以增强吉西他滨作用的mirna会引起人们的兴趣。
[0084]
最后，适体是可以设计并制成以高亲和力结合选定靶标的rna或dna寡核苷酸。在某些情况下，这些可以是细胞上的受体，或者特别是在癌细胞中上调的受体。可以将gem核苷酸附加或插入这些序列(取代c)以允许与癌细胞表面上的靶受体高亲和力结合，然后允许寡核苷酸被摄取到细胞中，吉西他滨在细胞中释放以发挥治疗作用。
[0085]
吉西他滨修饰的寡核苷酸(dna或rna)可以用于提高在多种癌症类型中癌症治疗选择。
[0086]
吉西他滨还能够作为放射增敏剂(提高肿瘤放射治疗的效能)。因此，将吉西他滨通过上述寡核苷酸的修饰递送至特定癌细胞是可行的。当吉西他滨已经被递送后，肿瘤就会暴露在辐射中，然后这会杀死肿瘤细胞。有时，这种辐射暴露会进一步产生针对该过程中释放的肿瘤特异性抗原的免疫反应。
[0087]
因此，含有吉西他滨或其他非核苷类似物的寡核苷酸可以成为癌症和其他疾病的可行的治疗方式，其中非核苷(或核苷酸)类似物可以是有效的。使用非核苷类似物或核苷酸类似物的另一个示例是治疗病毒性疾病。例如，在病毒性疾病中，可能共同施用含有非核苷(或核苷酸)类似物的寡核苷酸。这些可以包括核苷和核苷酸逆转录酶抑制剂(nrti)，例如齐多夫定、去羟肌苷、扎西他滨、司他夫定、拉米夫定、阿巴卡韦、恩曲他滨和替诺福韦，或非核苷逆转录酶抑制剂(nnrti)，例如奈韦拉平、地拉韦定、依法韦仑和依曲韦林。
[0088]
实施例
[0089]
实施例1
[0090]
方法
[0091]
bxpc3细胞以500个细胞/孔接种在两个384孔板中。第二天，细胞用各种浓度的cid2a、cid2s、cid4 sirna(用lipofectamine rnaimax配制)或吉西他滨(0.1-1000nm)处理72小时。在37℃孵育72小时后，使用ctg2试剂评估活细胞的数量。未处理的细胞设置为100％。
[0092]
sirna设计
[0093]
针对azorsa chk1序列的sirna获自论文(azorsa，同上)。这是在每条链的3'末端有2dtdt的碱基突出的19mer。为了检查使用额外sirna沉默rad17和chk1的能力，设计了25mer的平末端的sirna序列，其在小鼠和人基因之间具有同一性。
[0094]
sirna沉默靶标的验证(qrtpcr)
[0095]
数据显示了针对rad17或chk1设计的几种sirna对其沉默其各自靶标基因的能力的相对效果。这些实验使用如下所示的sirna进行。在使用(50nm)sirna转染的细胞中测量基因靶标沉默的程度，并且使用qrtpcr(使用β-肌动蛋白作为对照持家基因，用于数据的归一化)测量基因沉默的程度。
[0096]
结果
[0097]
图8显示胰腺癌细胞系bxpc3对使用lipofectamine为递送剂施用的非沉默性的sirna(ns/lipo)没有反应。然而，当使用相同试剂施用chk1 sirna(chk_az/lipo)时，随着剂量的增加，观察到细胞活力在72小时暴露后降低至约50％。制备了sirna寡核苷酸，其中
chk_az sirna序列的有义链中的2个胞嘧啶被gem取代(2s/lipo)，或者反义链中的2个胞嘧啶被gem取代(2a/lipo)。含有gem的有义链与未标记的反义链退火
‑‑
形成2s，或含有gem的反义链与未标记的有义链退火
‑‑
形成2a，或含有2个gem的有义链与含有2个gem的反义链退火形成化合物4。在选择的序列中，仅看到2s产物中对chk1基因的沉默活性。仅在2a产物中观察到代表吉西他滨的活性。此外，当gem-ss与gem-as退火以获得cpd4时，未观察到sirna序列的沉默效果，但由于每个sirna存在4个gem，观察到剂量反应向左移动。图8中的图显示了图下方表格中存在的数据。该表表示在表的顶行所示的浓度下(nm)在每种处理下存在的活细胞的百分比。
[0098]
这项研究的结果证实，可以在sirna的ss中添加gem，其增强sirna沉默对杀伤肿瘤细胞，特别是杀伤这种胰腺肿瘤系bxpc3的活性。见图8。
[0099]
非沉默性的sirna(ns)在72小时的孵育期中对细胞活力没有影响。吉西他滨暴露(无lipofectamine-gem)表现在降低细胞活力中的剂量依赖性(ic50为约7nm)。未修饰的chk1 sirna(chk-az)显示出至多0.1nm的剂量依赖性效应，但随后该效应在最大抑制50％的细胞活力时进入平台期。
[0100]
内部gem对chk1 sirna效能的影响
[0101]
如果在as链上包含2个gem(2a)，则剂量反应看起来与单独的gem剂量反应曲线非常相似。如果ss中包含2个gem(2s)，则剂量反应曲线的初始部分看起来更像是由chk1 sirna(0-0.1nm)产生的沉默。然而，与chk1 sirna效应在50％细胞活力时进入平台期不同，2s在1nm以上的浓度中继续对细胞活力产生抑制效应，并在50nm时最大，细胞活力为14％。这种效果看起来更像是单独使用gem时所见的反应(在相同浓度(50nm)下最大，细胞活力为26％)。两条链(每条含有2个gem)退火提供了每个sirna分子4个gem(c1d-4)。与2a相比，该物质的剂量反应向左移动(反映更多的gem增加了效价强度)。然而，与单独的chk1 sirna相比，未见初始的细胞活力降低，但曲线与仅有gem的曲线平行，这表明了对于每个sirna引入两倍gem的唯一效果。
[0102]
筛选鉴定出具有针对胰腺肿瘤细胞抑制效价强度的sirna序列
[0103]
图9显示的胰腺癌细胞系活力对转染针对chk1设计的8个sirna序列的敏感性。显示了将sirna序列转染到培养细胞后72小时的活细胞百分比(上图-bxpc3细胞；下图-cfpac细胞)。100％活力定义为存在非沉默性的对照sirna(ns)时的活力。chk1_az(az)作为对比进行了测试。cd＝细胞死亡sirna—已知转染到细胞中时产生针对许多细胞类型的最大杀伤。
[0104]
chk4序列在bxpc3细胞中提供最强效果。当chk4序列转染到另一种胰腺癌细胞-cfpac时，其对细胞活力也有非常显著的效果。
[0105]
测试的序列是：
[0106]
1.gggagaaggtgcctatggagaagtt
[0107]
2.ggagaagttcaacttgctgtgaata
[0108]
3.ccagttgatgtttggtcctgtggaa
[0109]
4.cctgtggaatagtacttactgcaat
[0110]
5.ggaataactcacagggata
[0111]
6.gggatattaaaccagaaaa
[0112]
7.gcagaaccagttgatgttt
[0113]
8.ggaatagtacttactgcaa
[0114]
chk4在bxpc3细胞中显示出比chk-az(chk1 sirna序列来自azorsa论文)更大的效价强度。此外，相较于chk1_az上的2个胞嘧啶，该序列有可以被gem取代3个胞嘧啶。相较于修饰的chk1_az，其通过每个分子递送更多的gem，为沉默chk1基因提供了具有更大效价强度的可能性，并且进一步增强这种活性并提高了效价强度和效能。
[0115]
这些数据表明：
[0116]
1.与单独的sirna相比，在chk1 sirna的ss上放置2个gem可提高效能。
[0117]
2.在as链上放置2个gem—我们没有看到sirna沉默效应的效果，但我们确实看到了gem对细胞活力的影响。
[0118]
3.对as和ss(每条都包含2个gem)进行退火，产生的每个分子具有4个gem。然而，与#2一样，as链上的2个gem阻止了as链产生基因沉默效应，我们只看到由于我们每个sirna递送4个gem的提高的效价强度。
[0119]
4.在每条链的3'末端添加dtdt部分可以减慢gem的释放，从而允许区分效应与基因沉默效应。
[0120]
5.如果as链中的gem破坏了as链与risc复合物结合以及诱导靶标基因沉默的能力，则它们可以抑制sirna的效能。然而，as链3’末端的gem已被证明显示出与由as链诱导的沉默相加的活性。可添加1或2个gem用于此相加的活性。也可以添加额外的gem。
[0121]
6.ss上的gem通过表现出sirna介导的沉默加上gem对细胞活力的抑制作用从而提高了效能。
[0122]
将这种具有2
×
gem的ss链和具有2
×
gem的as链组合，因为具有4个gem，所以产生更好的效能，但不具有sirna对靶标基因的沉默。
[0123]
改进的chk1 sirna(chk_de4)相较于之前研究中的azorsa序列显示出更好的沉默。
[0124]
测试的序列如下：(这些表示有义链序列)chk_x
[0125][0126]
#4序列cctgtggaatagtacttactgcaat看上去是最优的。
[0127]
因此，ss＝
[0128]
ss＝5
’‑
ccu gug gaa uag ua[gem]uua[gem]ug[gem]aa u-3’([gem]取代了“c”)
[0129]
as＝5
’‑
a uug cag uaa gua cua uuc cac agg-3’(在as链上没有gem)
[0130]
制备全部碱基修饰的as。制备全部修饰(2'-o-me)的ss，并制备全部未修饰的作为
比较。
[0131]
其他目的序列：
[0132]
chk1a：靶标序列：chk1-a：aagaaagagaucuguaucaau；2处gem取代了“c”[0133]
chk1b：靶标序列：chk1-b：uuggaauaacuccacgggaua。在该序列中有4处放置gem。
[0134]
我们预计在ss具有4个gem的chk1-b_az(chk1-b_az with 4gem ss)比具有2个gem的chk1a显示更好的活性。
[0135]
吉西他滨用于治疗多种癌症，包括膀胱癌、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌和非小细胞肺癌。这些其他癌症类型可以使用本文所述的方法进行治疗，任选地使用额外的sirna分子来增强活性。
[0136]
实施例2
[0137]
胰腺癌bxpc3细胞以1000个细胞/ml接种在384孔板中并以单层生长。使用lipofectamine(thermofisher)用针对chk1或rad17的sirna转染细胞，或用x轴上所示浓度的吉西他滨处理。在37℃和5％co2中孵育96小时后，使用cell titer glo(perkin elmer)，通过配备有超灵敏发光检测光学器件的perkin elmer envision酶标仪监测试剂产生的发光信号来确定细胞活力。从图中我们可以看到，吉西他滨(gem)对细胞活力产生剂量依赖性抑制，其中ic50约为6nm，最大效能为》80％的细胞杀伤。针对rad17的25mer的平末端sirna产生了对细胞活力的剂量依赖性抑制，其中最大效能为细胞活力仅降低60％以及ic50约为5nm。使用先前公布的针对chk1的19mer sirna序列(来自azorsa，同上)，我们观察到在细胞活力中的最大效能与rad17 sirna相似。针对chk1的平末端25mer sirna显示出比azorsa chk1 sirna序列更大的效能，在100nm时抑制约90％的细胞活力。后者sirna的ic50与azorsa序列的ic50相似(约0.3nm)。图11所示的结果表明，针对chk1和rad17的sirna单独可以抑制胰腺癌细胞的活力。
[0138]
实施例3
[0139]
合成sirna，其中在所示sirna序列的每条有义链的3'末端添加吉西他滨核苷酸酰胺化物。将sirna转染到细胞中并如图1详述进行孵育。现在，所有序列的最大效能提高到在10nm以上浓度时抑制》95％的细胞活力。在非常低的浓度(0.1nm)下，吉西他滨修饰的rad17 sirna本身对细胞活力没有影响，而相同浓度的吉西他滨修饰的chk1 sirna对细胞活力产生31％的抑制(25mer)或56％的抑制(19mer)。检查吉西他滨核苷酸以查看其是否可以取代sirna序列中的胞嘧啶核苷酸。az chk1序列具有2个被gem取代的“c”基团，我们可以看到该sirna(chk1-az-2s)的行为与在3'末端具有2个gem的sirna(chk-az-poly2)几乎相同。图12a至图12d显示了在每条sirna的有义链的3'末端添加2个吉西他滨核苷酸对效价强度和效能的影响。
[0140]
实施例4
[0141]
用sirna构建体转染以1000个细胞/孔接种在384孔板中的bxpc3细胞，或将bxpc3细胞暴露于如图所示浓度的吉西他滨中。测试的样本是单独的吉西他滨(gem)、针对chk1的未修饰19mer sirna(chk-az)，以及相同序列的sirna，但在有义链与相同的反义链退火之前，在有义链的3'末端具有添加的2(poly-2)、4(poly-4)或6(poly-6)个吉西他滨核苷酸。在暴露于各种试剂120小时后，通过以下测定细胞活力：添加cell titer glo(pe)，将板震荡10至20分钟，然后在pe envision酶标仪中测定与细胞活力相关的发光信号。图13显示了
在有义链的3'末端添加额外的gem对效能和效价强度的影响。
[0142]
由此可以推理出，既然在sirna的ss上添加2个gem核苷酸就能获得对胰腺癌细胞活力效能上的这种提高，那么添加额外的gem将进一步提高sirna的效能和/或效价强度。为此，将未修饰的19mer sirna(chk-az)与在ss的3'末端添加2个gem(poly-2)、添加4个gem(poly-4)或添加6个gem(poly-6)的相同序列进行比较。将这些序列与仅使用吉西他滨(gem)进行比较。该实验是通过将sirna转染进bxpc3细胞进行的(如图1所示)，但是在测量细胞活力之前的暴露时间为120小时。由于更长的孵育时间，所以sirna的剂量反应可以在低得多的浓度下探索。这能够确定真实的ic
50
值。gem本身在该细胞系中产生完全的剂量反应，并且在此孵育时间中产生3nm的ic
50
，在浓度在50nm以上时细胞活力降低了100％。未修饰的19mer sirna(chk-az)的ic
50
为0.16nm。然而，即使在这种延长的暴露时间下，效能最大为抑制约70％的细胞活力。在sirna的3'末端添加2、4或6个gem均提高了产物的最大效能，使得在浓度在10nm以上时细胞活力低于10％。然而，预计更多的gem能提高sirna效价强度并未实现，具有2个gem的序列比具有4个或6个gem的构建体更有效。2gem构建体的ic
50
(0.026nm)相较于单独的吉西他滨(3nm)提高了115倍。这些数据表明，在sirna的ss的3'末端具有超过2个的gem对构建体在细胞活力测定中的效价强度或效能没有额外的效果。
[0143]
实施例4
[0144]
用chk1/gem sirna的不同变体(50nm)转染bxpc3细胞(2.5
×
105细胞/12孔板的孔)。转染24小时后，通过sybr green rt-pcr测定chk1 rna的相对水平。b-肌动蛋白的表达水平用于归一化。使用δδct方法计算所有样品中的mrna水平相对于未处理细胞中的mrna水平。
[0145]
2agem/chk
–
2个吉西他滨取代chk1 sirna的反义链上的c
[0146]
2agem/ns
–
2个吉西他滨取代非沉默性sirna的反义链上的c
[0147]
2sgem/chk
–
2个吉西他滨取代chk1 sirna的有义链上的c
[0148]
2sgem/ns
–
2个吉西他滨取代非沉默性的sirna的有义链上的c
[0149]
4gem/chk
–
2个吉西他滨取代chk1 sirna有义链上的c并且2个吉西他滨取代chk1 sirna的反义链上的c
[0150]
4gem/ns
–
2个吉西他滨取代非沉默性的sirna的有义链上的c并且2个吉西他滨取代非沉默性的sirna反义链上的c
[0151]
blnk
–
未经处理的样品
[0152]
chk_az(a)
–
未修饰的chk1 sirna
[0153]
nc-非沉默性的sirna单独。
[0154]
图14显示了在有义/反义链中插入吉西他滨的效果以及对基因沉默的效果(qpcr结果)。
[0155]
实施例5
[0156]
用gem修饰的sirna在bxpc3细胞中观察到的结果取决于暴露在这些试剂中的时间。图15显示了sirna和sirna-gem构建体在细胞活力方面的效能的时间依赖性。检查暴露于不同浓度的化合物的细胞的在48小时(左图)、72小时(中图)或120小时(右图)处的活力。可以看出，在每个时间点，在最高浓度(100nm)时，未标记的sirna(chk-az)显示出比gem修饰的sirna(poly-2、poly-4或poly-6
‑‑
在3'末端包含2个、4个或6个吉西他滨部分)更弱的
效果。同时含有2个gem(poly-2)的sirna相比于含有4个(poly-4)或6个gem(poly-6)的sirna在效价强度或效能上没有太大差异，每种polygem构建体的细胞杀伤程度都随着暴露时间的增加而增加(从48小时的约40％，到72小时的约70％以及120小时的100％)。该数据表明，进入细胞的每个sirna仅释放1或2个吉西他滨分子。此外，时间依赖性可能反映了获得强效的基因沉默以增强gem本身的效果所需的时间，或者其可能表明激活释放的gem所需的过程也需要时间。其是释放吉西他滨部分所需的时间，然后是核苷酸的三磷酸化以产生活性部分所需的时间，该活性部分可以通过将核酸酶稳定的gem核苷掺入到延伸的序列中来阻断复制叉。其还可以取决于特定细胞类型的细胞周期和分裂(复制)时间—对于bxpc3，这是大约48至60小时，因此在120小时处我们将经历2至3个分裂周期，而在72小时处只经历1个分裂周期。
[0157]
实施例6
[0158]
我们进一步确定gem核苷酸是否可用于取代sirna的反义(as)链中的sirna内的胞嘧啶核苷酸。为探明这一点，我们再次使用来自azorsa等人的针对chk1的19mer sirna序列。见图16：
[0159]
2a-chk1是指2个gem取代沉默chk1的sirna的as链中的c
[0160]
2a/ns是指2个gem取代非沉默性(ns)的sirna序列中的c
[0161]
2s/chk1是指2个gem取代针对chk1的sirna的有义链中的c
[0162]
2s/ns是指2个gem取代非沉默性(ns)的sirna的有义链中的c。
[0163]
cid4/chk1指的是chk1 sirna，其中ss和as链各包含2个gem-使单个sirna具有4个存在的gem。
[0164]
cid4/ns指非沉默性(ns)的sirna，其中ss和as链各包含2个gem-使退火后的单个sirna具有4个存在的gem。
[0165]
将这些构建体中的每一种转染到以每孔1000个细胞的密度在384孔板中的bxpc3细胞中。随后，细胞在转染后，在37℃在5％co2和95％的湿度下孵育120小时，然后如前所述使用cell titer glo(pe)测量细胞活力。
[0166]
该实验表明，将2个gem掺入靶向chk1的sirna的ss(2s/chk1)中会产生沉默该基因以及在细胞内释放吉西他滨的联合效果—产生在ic50(0.35nm)中移动同时也保持完全的效能。这相较于将2个gem掺入非沉默性(ns)的sirna的ss，我们没有获得沉默chk1以见到其与gem释放的协同作用的益处，我们只见到gem释放对ic50(5.4nm)的显而易见的影响。因此，只需在chk1 sirna中添加2个gem，我们就见到比在ns sirna的ss中具有2个gem约15倍的提高。
[0167]
在chk1和ns sirna的as链中添加2个gem，我们发现chk1-gem ic50(2a-chk1)降低到1.975nm，与之相比，ns sirna(2a/ns)在6.68nm。这表明，在chk1的as序列中具有gem相较于ns-gem仍然可以产生一些效能，但效果差异仅为3倍，并且在chk1的as链中插入gem导致与ss中插入2个gem相比效价强度减少约6倍。这表明as链中的gem干扰as链的沉默能力—因此我们没有得到通过沉默chk1基因所诱导的增强。在chk1 as和ss链均具有2个掺入的gem的sirna链的组合的ic50(cid4/chk1；1.8nm)非常接近于仅在as链中掺入2个gem的sirna的ic50(2a-chk1；1.98nm)。这表明添加4个gem几乎无益，而且我们看到的效价强度与我们在ss中有2个gem时的效价强度相同。这与预期一致，即as链在risc复合物中保持完整以进行
基因沉默(但该链上的gem阻止了良好的沉默)，而有义链上的2个gem(即当as并入到risc中时，有义链从as链中解开，然后被细胞质中的核酸酶切割)被释放并有助于观察到的最大活性。这甚至对于ns sirna也是一致的，因为2s/ns ic50(5.4nm)与cid4/ns ic50(5.19nm)非常相似。
[0168]
2s/ns、2a/ns和cid4/ns的曲线都重叠并且具有比chk1被沉默时的曲线低得多的ic50。前一种sirna没有基因沉默作用，因此它们的所有效果仅仅是因为切割过程中释放了ss上存在的2个gem—提供与单独使用吉西他滨时的剂量反应相当的ic
50
值和效果(见图13和图14)。图16显示了在as链中包含取代c的gem的效果。
[0169]
实施例7.
[0170]
表1：polygem chk1-az sirna序列的结构
[0171]
下表显示了与azorsa 19mer sirna一起使用的polygem构建体的有义链序列。将2、4或6个gem核苷酸插入到sirna的ss的3'末端的dtdt 2碱基突出之前。合成后，由于释放2个gem，通过hplc单独评估每个寡核苷酸的纯度，我们观察到3个寡核苷酸中的每一个的纯度为75-82％(右栏)。然后，将这些序列中的每一个(或未添加任何gem的相同ss)与相应的碱基匹配的as链退火以形成sirna双链体。通过a260/a280测量确定每个双链体的浓度，并显示在第3栏中。
[0172][0173]
表2.测试的sirna的有义链和反义链序列的效能和效价强度
[0174][0175][0176]
上述序列用于退火以生成双链的25mer平末端的sirna。序列1是25mer平末端sirna，没有任何gem掺入ss序列。序列2有2个gem连接在有义链的3'末端，然后与序列#1中
相同的as链退火。序列5和6是相同的as链，但是其中ss的前2个碱基被去掉以缩短序列(这是为了试图强制使用另一条链作为as链)。序列5和6的不同之处在于，序列6不包含在seq5的第13位(或原始ss序列中的第15位)取代胞嘧啶基团的gem。这种排除法的原理是为了确定在这个位置插入gem是否阻断ss的切割，而ss的切割可能是在沉默过程中将as链装载到risc复合物所需要的。序列7与序列6相同，但包括2个gem取代有义链的5'末端存在的2个胞嘧啶(以查看每个sirna添加更多gem是否会提高最终构建体的效价强度或效能)。序列3是针对rad17的未标记的25mer平末端sirna，而序列4是相同的sirna，但在ss的3’末端连接了2个额外的gem。
[0177]
测试了表2中所示的sirna序列在暴露120小时后对bxpc3胰腺癌细胞活力的效能和效价强度。上图显示了单独滴定吉西他滨(gem)在暴露120小时后对所测定的bxpc3细胞活力的效果。ic50为约5nm，但最大效能仅为抑制约85％的细胞活力(即使在100nm时也是如此)。
[0178]
针对rad17的未修饰sirna(sl-p49-3)显示出细胞活力的剂量依赖性降低，ic50为约4nm，最大效能仅为抑制60％的细胞活力。当此sirna在有义链的3'末端具有添加的2个吉西他滨部分时，我们看到效能显著提高(在30nm时，100％杀伤细胞)而效价强度没有变化(ic50为约4nm)。
[0179]
25mer平末端sirna序列在不使用gem修饰的情况下被证明对细胞杀伤具有非常有效的作用(sl-p49-1；ic50 0.25nm和100nm时的效能为90％)。
[0180]
与rad17一样，在ss的3'末端添加2个gem会产生具有相似ic50值但效能更高的产物(sl-p49-2)(在30nm时抑制约100％)。
[0181]
图17显示了sirna的ss中gem位置和修饰的数量对sirna/gem联合的效能和效价强度的影响。
[0182]
含有2个gem的chk1 sirna(sl-p49-6)或含有3个gem的chk1 sirna(sl-p49-5)的ss的5'末端被缩短会产生相同的效果(ic50为约3nm；在30nm处最大效能为83-97％)。这表明通过从任一sirna中释放单个gem增强的中等沉默效果。
[0183]
与仅包含2个gem的序列(sl-49p-2)相比，使用包含4个取代c的gem的相同ss序列(sl-p49-7)给出相似的ic50和效能值。这一结果表明，这种sirna反义链序列提供了最大量的基因沉默，但从含有2个或4个gem的ss中释放的gem产生了相同的效能提高—表明释放4个gem相较于释放2个并不会提高效能，所以这一定是gem的饱和效果。当每个分子具有1个以上的gem时，有可能没有对gem进行进一步切割以产生加成效应。我们认为，当第二个gem以相同顺序直接连接到另一个gem时(例如，在表2和上图的sl-p49-2中)，外切核酸酶可能无法将其切割并释放。然而，即使我们通过对核酸酶敏感的核苷酸将gem分隔开(例如，在sl-49p-5或sl-49p-7中)，我们也没有看到在效价强度或效能上有任何进一步的提高。结果表明，只有一个gem可以提供所见效果。这可能是由于在sirna risc加载过程中，从as链释放ss需要时间的结果，所述ss在细胞质中降解并释放gem，其然后需要磷酸化以插入到dna复制叉结构中。或者，释放的gem的数量可能与细胞复制周期相关，因此在gem掺入复制叉的速率方面受到限制。
[0184]
实施例8
[0185]
使用吉西他滨或与对bxpc3细胞所使用的相同的未修饰sirna和暴露时间(96小
时)(图1)，我们研究对另一种胰腺癌细胞系miapaca-2的影响。与在bxpc3细胞中一样，单独的吉西他滨会在细胞活力上产生剂量依赖性的降低，具有相似的ic50值和最大效能。虽然针对chk1设计的19mer sirna(chk-az)和25mer平末端sirna都显示出相似的效能(最大抑制约80％)，但这远大于在bxpc3细胞中对19mer所观察到的60％抑制，却类似在这些细胞对25mer所观察到的。然而，当单独使用rad17 sirna对抗miapaca细胞时(最大抑制仅约30％)，与对bxpc3细胞(最大抑制约60％)相比，rad17 sirna显示出显著降低的效能。图18显示构建体在另一种胰腺肿瘤细胞-miapaca中的作用。
[0186]
实施例9
[0187]
在miapaca细胞中，2个未修饰的sirna(chk1_de(25mer平末端序列)或chk-az(具有2个碱基dtdt突出的19mer))显示出相似的80％抑制最大效能。在chk1-az序列中添加2个gem(在ss的3’末端(chk-az-poly2)或通过取代ss内的c(chk1-az-2s))，导致在sirna杀伤miapaca细胞上的效能显著提高(在10nm时最大抑制为约100％)。在25mer sirna的ss的3'末端添加2个gem(chkde_2gem)也是如此，这也导致对于miapaca细胞在10nm时具有约100％的最大效能。虽然未修饰的靶向rad17的25mer sirna对miapaca细胞活力几乎没有效能(最大约25％)，但在该sirna的ss的3’末端添加2个gem显著提高了该构建体的效能(在30nm时抑制93％)。所有修饰的sirna现在显示出超出单独使用吉西他滨所能达到的最大效能(在100nm时的最大抑制为90％)。图19显示了gem修饰的sirna对miapaca细胞的影响。
[0188]
尽管本发明已经结合其某些实施方案进行了描述，并且为了说明的目的已经阐述了许多细节，但对于本领域的技术人员来说，显然本发明可以有其他的实施方案，而且在不背离本发明的基本原则的情况下，可以改变这里描述的某些细节。