专利名称：氨苷霉素分离及纯化的方法
技术领域：
本发明涉及氨苷霉素分离及纯化的方法。
背景技术：
氨苷霉素是作为杀菌剂的有效成分用于防治植物白粉病。关于氨苷霉素的分离纯化方法，在美国专利4296107(Suzuki et al.，1981)中记述首先向发酵液中加入絮凝剂Hyflosupercel，过滤得到滤液；然后用活性炭柱吸附，水冲洗后，用正丁醇水溶液洗脱；洗脱液用Amberlite CG-50柱吸附，水冲洗后，氨水洗脱，洗脱液减压浓缩；浓缩液用乙醇沉淀，收集沉淀，干燥，得到氨苷霉素粉末。在文献(Setsuo Harada et al.，1978)中记述首先用Amberlite IRC-50树脂柱吸附，氨水洗脱，洗脱液用活性炭柱吸附，丙酮水溶液洗脱，洗脱液浓缩，加入丙酮沉淀，得到氨苷霉素粉末。在实验中我们发现，上述工艺有以下不足之处1.发酵液的预处理十分重要，直接影响后续分离的效果，文献报道的工艺对此未做深入研究；2.活性炭柱的脱色效果不理想，而且对目标产物氨苷霉素有较大的吸附量，产品损失达40％；3.整个工艺的收率比较低，只有35％，而且产品的色泽较深，呈棕黄色，产品纯度低。
发明内容
本发明的目的是提供一种工艺流程短，操作简便，而且具有收率高、产品纯度高、色泽好，适用于工业化生产的氨苷霉素分离纯化的方法。
本发明的氨苷霉素分离及纯化的方法，其特征是包括以下步骤1)向含氨苷霉素的发酵液中加入草酸，调节pH值至1～3，静置，过滤或离心，得到澄清滤液，然后用碱调至pH7.0～7.5，静置，过滤去沉淀，得到澄清的预处理液；2)将预处理的发酵液，用弱酸性阳离子交换树脂以0.3～2倍树脂体积/小时流速吸附，优选0.5倍树脂体积/小时流速，用浓度为2～3.5％氨水以0.5～2.5倍树脂体积/小时流速洗脱，优选1倍树脂体积/小时流速，收集活性组分，得到洗脱液；3)洗脱液用酸调至pH7.0-7.5后用阴离子交换树脂以2～4倍树脂体积的流速脱色，优选4倍树脂体积/小时流速，收集活性组分，得到脱色液，即氨苷霉素的粗品；
上述方法的进一步特征是，将得到的氨苷霉素的粗品用无机酸调整pH值至7.0，减压浓缩，乙醇沉淀，干燥，得固体状氨苷霉素的粗品。
为了得到氨苷霉素的纯品，本发明方法还包括将氨苷霉素的粗品再用锂离子型HD2层析树脂对粗品提纯，其中HD2层析树脂预先用0.3mol/l pH8.8的硼酸锂缓冲液浸泡，上层析柱平衡至流出液pH8.8，该硼酸锂缓冲液由0.3mol/l氢氧化锂与0.3mol/l硼酸按体积比1∶3混合反应后加入5％体积的甲醇而成，树脂平衡后以0.1～1倍树脂体积的流速上HD2层析柱，上样结束后，用硼酸锂缓冲液进行洗脱，收集活性组分；将所得的活性组分通过弱酸性阳离子交换树脂以0.3～2倍树脂体积/小时的流速吸附，用去离子水冲洗，用浓度为2～3.5％氨水以0.5～2.5倍树脂体积/小时流速洗脱，收集活性组份，得到洗脱液；然后用001×16树脂去除氨苷霉素溶液中的小分子无机盐；调整pH值至7.0，减压浓缩，乙醇沉淀，干燥，得到氨苷霉素的纯品。
本发明中，所说的弱酸性阳离子交换树脂可以采用110、JK110、HD2、D113、D115、D151或D152。阴离子交换树脂为D201、D241、D261、D293、D296、D303、D315、D345、D730、D750或HZ202。
本发明方法工艺流程短，操作简便，生产成本低，易于实现工业化生产，且具有收率高、产品纯度高、色泽好的优点。所得氨苷霉素产品的纯度可达95％，回收率75％。该氨苷霉素粉剂对农作物白粉病、黄瓜白粉病、番茄晚疫病等有显著的防治效果。
具体实施例方式
以下结合实例进一步说明本发明。
实施例18升含氨苷霉素的发酵液，加入草酸调节pH值至2，静置，过滤，得6升滤液，用饱和氢氧化钠调至pH7.5，用300毫升/小时的流速通过600毫升JK110阳离子交换树脂柱，用2升去离子水冲洗，再用1升2％氨水以600毫升/小时洗脱，收集活性组份，得到洗脱液；洗脱液用浓盐酸调至pH7.0-7.5，以2升/小时的流速通过500毫升D296阴离子交换树脂柱脱色，收集流出液中的活性组分，得到氨苷霉素的粗品；使用无机酸(盐酸、硫酸、磷酸)将氨苷霉素的粗品调整至pH7.0后减压浓缩，得100毫升浓缩液。向浓缩液中加入乙醇，收集沉淀，50度减压干燥，得到氨苷霉素的粗品的白色粉末。
实施例21000升含氨苷霉素的发酵液，加入20公斤草酸调节pH值至2，静置，板框压滤，得800升滤液，用饱和氢氧化钠调至pH7.5，以100升/小时的流速通过200升的阳离子交换树脂柱。用600升去离子水冲洗，然后用2％氨水以200升/小时洗脱，收集活性组份，得到500升洗脱液；洗脱液用浓盐酸调至pH7.0-7.5，以1600升/小时流速通过400升阴离子交换树脂柱脱色，收集流出液中的活性组分，得到800升脱色液。使用10mol/l盐酸将脱色液调整至pH7.0后减压浓缩，得到80升浓缩液。向浓缩液中加入400升乙醇，收集沉淀，50度减压干燥，得到350克氨苷霉素白色粉末。
实施例3将实施例2中所得的氨苷霉素粉末40克溶解到0.4升pH8.8含5％甲醇的硼酸锂缓冲液中，所使用的0.3mol/l pH8.8的硼酸锂缓冲液，由0.3mol/l LiOH与0.3mol/l硼酸按体积比1∶3混合反应后加入5％体积的甲醇得到。HD2树脂使用前需用缓冲液浸泡数次，至pH8.8左右，使其完全转为锂型，然后装柱。将0.4升氨苷霉素样品溶液，以2.4升/小时的流速通过10升HD2树脂柱。上样结束后，用硼酸锂缓冲液以2.4升/小时的流速进行洗脱，收集活性组分。将所得的活性组分以5升/小时的流速通过10升JK110树脂柱吸附，用30升去离子水冲洗，然后用2％氨水以10升/小时的流速洗脱，收集活性组份，得到20升洗脱液。洗脱液减压浓缩后，以1.2升/小时的流速通过0.5升的001×16树脂柱，去除氨苷霉素溶液中的小分子无机盐(如氯化钠、氯化铵等)，上样完成后用0.5升的去离子水冲洗，收集活性组份，得到1.3升脱盐溶液。调整pH值至7.0，50度减压浓缩后，向浓缩液中加入3升乙醇，收集沉淀，干燥，得到30克氨苷霉素粉末。最终产品纯度为95％，回收率为75％。
实施例4测试5.5％氨苷霉素可溶性粉剂对黄瓜白粉病(Sphaerotheca fuliginea)的防治效果。这里，5.5％氨苷霉素可溶性粉剂由5.5份氨苷霉素、3份表面活性剂和91.5份可溶性淀粉混合而成。表面活性剂可以是聚氧乙烯烷基芳基酯类，、硬酯酸钠或SDS，可溶性淀粉可用葡萄糖或乳糖等代替。对照药剂采用20％三唑酮乳油，为目前农业生产中常用的白粉病防治药剂。试验对象为黄瓜白粉病。选择2片真叶期的盆栽黄瓜苗，分别使用氨苷霉素可溶性粉剂和三唑酮对黄瓜苗进行喷雾处理，自然晾干，在药剂处理后24小时接种进行。接种方法采用孢子悬浮液(浓度控制在1.5×105个/毫升左右)喷雾接种，每盘(80～90盆苗)喷菌液40毫升，自然晾干，然后移至恒温室(25℃左右)中保湿培养，7天后视对照发病情况调查防效。结果见表1。
表1黄瓜白粉病盆栽活性测定结果
权利要求
1.氨苷霉素分离及纯化的方法，其特征是包括以下步骤1)向含氨苷霉素的发酵液中加入草酸，调节pH值至1～3，静置，过滤或离心，得到澄清滤液，然后用碱调至pH7.0～7.5，静置，过滤去沉淀，得到澄清的预处理液；2)将预处理的发酵液，用弱酸性阳离子交换树脂以0.3～2倍树脂体积/小时流速吸附，用浓度为2～3.5％氨水以0.5～2.5倍树脂体积/小时流速洗脱，收集活性组分，得到洗脱液；3)洗脱液用酸调至pH7.0-7.5后用阴离子交换树脂以2～4倍树脂体积的流速脱色，收集活性组分，得到氨苷霉素的粗品。
2.根据权利要求1所述的氨苷霉素分离及纯化的方法，其特征是将得到的氨苷霉素的粗品用无机酸调整pH值至7.0，减压浓缩，乙醇沉淀，干燥。
3.根据权利要求1所述的氨苷霉素分离及纯化的方法，其特征是还包括将氨苷霉素的粗品再用锂离子型HD2层析树脂对粗品提纯，其中HD2层析树脂预先用0.3mol/l pH8.8的硼酸锂缓冲液浸泡，上层析柱平衡至流出液pH8.8，该硼酸锂缓冲液由0.3mol/l氢氧化锂与0.3mol/l硼酸按体积比1∶3混合反应后加入5％体积的甲醇而成，树脂平衡后以0.1～1倍树脂体积的流速上HD2层析柱，上样结束后，用硼酸锂缓冲液进行洗脱，收集活性组分；将所得的活性组分通过弱酸性阳离子交换树脂以0.3～2倍树脂体积/小时的流速吸附，用去离子水冲洗，用浓度为2～3.5％氨水以0.5～2.5倍树脂体积/小时流速洗脱，收集活性组份，得到洗脱液；然后用001×16树脂去除氨苷霉素溶液中的小分子无机盐；调整pH值至7.0，减压浓缩，乙醇沉淀，干燥，得到氨苷霉素的纯品。
4.根据权利要求1或3所述的氨苷霉素分离及纯化的方法，其特征是所说的弱酸性阳离子交换树脂为110、JK110、HD2、D113、D115、D151或D152。
5.根据权利要求1所述的氨苷霉素分离及纯化的方法，其特征是所说的阴离子交换树脂为D201、D241、D261、D293、D296、D303、D315、D345、D730、D750或HZ202。
6.根据权利要求1所述的氨苷霉素分离及纯化的方法，其特征是步骤2)用弱酸性阳离子交换树脂以0.5倍树脂体积/小时流速吸附，用浓度为2～3.5％氨水以1倍树脂体积/小时流速洗脱。
全文摘要
本发明公开了氨苷霉素分离及纯化的方法，包括发酵液预处理、用阳离子交换树脂初步分离、阴离子交换树脂脱色、HD2层析树脂精制及强酸树脂脱盐、减压浓缩、乙醇沉淀及干燥。该方法不仅工艺流程短，操作简便，而且具有收率高，产品纯度高，色泽好的优点，适用于氨苷霉素的工业化生产。该氨苷霉素粉剂对农作物白粉病、黄瓜白粉病、番茄晚疫病等有显著的防治效果。
文档编号C12P17/18GK1710089SQ20051005043
公开日2005年12月21日 申请日期2005年6月24日 优先权日2005年6月24日
发明者徐志南, 陈勇, 沈文和, 岑沛霖 申请人:浙江大学