专利名称:一种编码β-葡萄糖苷酶的基因及应用的制作方法
—种编码β-葡萄糖苷酶的基因及应用技术领域：
[0001]本发明涉及从未培养微生物中克隆的酶基因，尤其涉及通过构建芒草驯养牛瘤胃未培养微生物的宏基因组DNA文库而筛选得到的酶基因。
背景技术：
[0002]纤维素是地球上丰富且可再生的生物聚合物。由于其结构复杂，所以纤维素降解过程依靠复杂的多酶体系即内切纤维素酶、外切纤维素酶与β -葡萄糖苷酶三种酶的协同作用才能完成，其中β_葡萄糖苷酶是此过程的限速酶。[0003]葡萄糖苷酶在自然界的分布较为广泛。目前针对微生物中的葡萄糖苷酶的研究文献主要集中在酵母、真菌、细菌中。夏永振应用表面表达技术将来自Trichoderma reesei的β -葡萄糖苷酶在酿酒酵母表面进行表达，并研究其酶学性质，实验结果表明酵母表面表达的酶有活性，产酶的最佳诱导时间为24 h,最适温度是70°C。Shipkowski和 Brenchley在Paenibacillus sp. strain C7中发现一种耐低温的β -葡萄糖苷酶,该酶属于糖苷水解酶家族 3 (Shipkowski et al. , 2005)。Brunner 等从致病疫霉 Phytophthora infestans中获得的基因bgxl,编码一个具有木糖酶/ β -葡萄糖苷酶的双功能酶。[0004]公开号为CN1778907的中国专利介绍了一种β -葡萄糖苷酶及其编码基因与应用，公开了一种β_葡萄糖苷酶及其编码基因与应用。本发明提供的β_葡萄糖苷酶，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质1)序列表中的SEQ ID NO 2 ；2)将序列表中SEQ ID NO 2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有 β_葡萄糖苷酶活性的蛋白质。本发明的β_葡萄糖苷酶及其编码基因在纤维素的降解中具有广泛的用途。[0005]公开号为CN1786171的中国专利介绍了一种嗜热碱性β _葡萄糖苷酶及其编码基因，涉及一种葡萄糖苷酶及其编码基因。该酶具有在高温、碱性条件下保持较高酶活性的特点，其最适反应温度约为70°C，最适反应pH值约为8.0，该酶能催化水解β-葡萄糖苷键生成葡萄糖，在食品、医药、纺织、能源等方面具有重要的应用价值。[0006]公开号为CN101050447的中国专利介绍了一种β _葡萄糖苷酶基因工程菌及其应用，公开了一种β-葡萄糖苷酶基因工程菌——大肠埃希氏菌(Escherichia coli)CGMCC No. 1626，以及该菌种在制备有效霉亚基胺A化合物中的应用。利用该工程菌转化有效霉素 A可得到有效霉亚基胺A产物，具有转化效率高、成本较低、反应条件温和、产物纯度高、分离纯化容易、化学污染少等优点。[0007]公开号为CN102268421A的中国专利介绍了一种β -葡萄糖苷酶基因的克隆、表达及应用，具体涉及一种能够分解乳糖的在高温和低温条件下都具备很强活性的β-葡萄糖苷酶，并能够高效表达的分泌型β_葡萄糖苷酶的基因工程菌。本发明公开了一种具有如 SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列的β -葡萄糖苷酶，并构建出能高效分泌所述β -葡萄糖苷酶的基因工程菌，并保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCCNo. 4891。本发明所述方法生产的β _葡萄糖苷酶具有很强的半乳糖苷酶的活性，可应用于乳品工业，同时被发明所述的β_葡萄糖苷酶在较大的PH值范围及温度范围内具有稳定的活性。[0008]公开号为CN102358898A的中国专利介绍了一种中温β -葡萄糖苷酶BglAl及其基因和应用，涉及一种中温葡萄糖苷酶BglAl及其基因和应用。本发明提供了一种新的中温葡萄糖苷酶BglAl，其具有如SEQ ID NO. I所示氨基酸序列，且本发明还提供了编码上述中温β-葡萄糖苷酶BglAl的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示，以及包含该基因的重组载体和重组菌株及其应用。本发明提供的中温β_葡萄糖苷酶BglAl最适pH 为6. 0，在pH 5. O 7. O都有较高的酶活性。最适温度为50°C，其耐热特性好，可使其在需求耐热环境的工业生产上应用。[0009]公开号为CN102399803A的中国专利介绍了一种改进的β -葡萄糖苷酶基因及其重组酶的制备，改进的β-葡萄糖苷酶基因及其重组酶的制备，改进的β-葡萄糖苷酶基因核苷酸序列bglll如SEQIDN0. I所述。本发明同时提供了以基础盐为培养基的该重组菌表达β_葡萄糖苷酶的方法。通过对基因的人工进化和高密度发酵，改造后的黑曲霉β_葡萄糖苷酶基因bglll在毕氏酵母中的表达量较原始基因bgll提高了 36倍。本发明可用于 β-葡萄糖苷酶基因的分子改造及其重组毕赤酵母基因工程菌的高密度发酵，能显著提高 β-葡萄糖苷酶的表达水平。[0010]公开号为CN102492710A的中国专利介绍了一种β -葡萄糖苷酶Cellb及其表达基因与应用，涉及β_葡萄糖苷酶Cellb及其表达基因与应用，属于生物工程技术领域：
。本发明提供一种表达β -葡萄糖苷酶Cellb的基因cellb，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示；本发明还提供一种葡萄糖苷酶Cellb，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。本发明中的β -葡萄糖苷酶Cellb可以用于工业上合成价格昂贵的纤维寡糖，进而应用于研究纤维素酶水解机理、微生物对纤维素的利用过程等。另外这种体外生物法合成的纤维寡糖可作为功能性食品或食品添加剂，也可作为糖尿病患者的甜味剂，还可以应用于化妆品工业和制药工业，其应用前景广阔。[0011]公开号为CN1500872的中国专利介绍了一种高温β-葡萄糖苷酶、其编码基因及其用途，由嗜热菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)MB4总DNA获得高温β -葡萄糖苷酶基因(β-glucosidase gene),构建了原核表达质粒,转化大肠杆菌表达β _葡萄糖苷酶。通过氨基酸序列比较，该酶为一新型葡萄糖苷酶。[0012]公开号为CN101100659的中国专利介绍了一种β -葡萄糖苷酶及其编码基因与应用，公开了一种β_葡萄糖苷酶及其编码基因与应用。该β_葡萄糖苷酶，是如下(a)或 (b)的蛋白质(a)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列3的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有β _葡萄糖苷酶活性的由(a)衍生的蛋白质。在以纤维素为原料生产燃料酒精的同步糖化共发酵工艺中的发酵微生物酵母菌最适发酵条件下，该酶具有较高的酶活，可以应用于该工艺中以生产燃料酒精。[0013]公开号为CN101363026的中国专利介绍了一种编码β _葡萄糖苷酶的基因，提供了一种编码β_葡萄糖苷酶的基因，名称为UnbgllB，它通过构建碱性污染土壤未培养微生物的宏基因组DNA文库和文库克隆的β-葡萄糖苷酶活性检测筛选法获得，是下列核苷酸序列之一 1)序列表中序列I的DNA序列及其部分序列；2)与序列表中序列I限定的DNA序列具有80%以上同源性的DNA序列。序列表中序列I的DNA是克隆载体pGEM_3Zf(+)部分DNA序列和克隆在该载体上的外源未培养微生物的DNA，该外源DNA片段由838个碱基组成，该基因的GC含量为54.3%。该基因用于生产β_葡萄糖苷酶，以将纤维二糖解离成单个葡萄糖分子。
公开号为CN1014 18306的中国专利介绍了一种耐高温β-葡萄糖苷酶基因在植物基因转化中的应用，涉及一种通过基因体外定向分子进化和定点突变相结合获得的耐高温β_葡萄糖苷酶基因在植物基因转化中作为报告基因的应用，属于植物基因工程领域。本发明公开了该耐高温β_葡萄糖苷酶基因在植物遗传转化中使用方法和效果。耐高温的β -葡萄糖苷酶基因可免除转基因生物体中内源背景的干扰，增加转基因检测的可靠性，使用耐高温β_葡萄糖苷酸酶还将明显提高转基因检测的灵敏度，使时空特异、生物或非生物环境诱导的表达调控研究结果差异更大、数据更准确，并且将大大降低底物的用量，降低检测成本。
公开号为CN101492661的中国专利介绍了一种β -葡萄糖苷酶基因的克隆、表达及用于龙胆低聚糖的制备，一种β_葡萄糖苷酶基因的克隆、表达及用于龙胆低聚糖的制备，属于酶基因工程和酶工程领域。本发明由黑曲霉WX-07总RNA逆转录合成β-葡萄糖苷酶基因(bgl)SEQ ID N0:1，bgl的cDNA以质粒pPIC9K为表达载体，以毕赤酵母(P. pastoris)为表达宿主，实现bgl基因在胞外的可溶性表达；bgl的cDNA全长2523个核苷酸，编码841个氨基酸，构建的bgl/pPIC9K转化P.pastoris KM71可表达BGL酶。BGL酶具有转糖苷活性，能将葡萄糖转糖苷生成龙胆低聚糖。优化酶法制备龙胆低聚糖的工艺，并利用阳离子树脂进行分离精制，达到较好效果。制得的龙胆低聚糖产品作为功能性食品配料，具有低热量，低龋齿，整肠等生理功能。本发明为龙胆低聚糖的制备提供了具有商业化价值的新途径。
公开号为CN101880680A的中国专利介绍了一种编码β -葡萄糖苷酶的基因及其应用，一种编码葡萄糖苷酶的基因bgl，含有SEQ ID NO: I的核苷酸序列或其功能等同变异体。本发明含涉及该基因或其功能等同变异体编码的葡萄糖苷酶(SEQ ID Ν02)及该酶在降解纤维素中的应用。
公开号为CN102477417A的中国专利介绍了一种β -葡萄糖苷酶及其编码基因与应用，公开了一种β_葡萄糖苷酶及其编码基因与应用。本发明提供的β_葡萄糖苷酶是如下I)或2)的蛋白质1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有β_葡萄糖苷酶活性的由I)衍生的蛋白质。实验证明该重组酶在毕赤酵母中高效分泌表达高达190. 2U/mL，该重组酶最适pH和最适温度分别为pH6. O和55 °C，具有较宽的底物作用范围和良好的热稳定性，且可水解纤维多糖、大麦葡聚糖、地衣多糖和昆布多糖。该重组酶具有一定的转糖苷能力，利用纤维二糖为底物，可以生成纤维三糖、龙胆二糖等，在食品、饲料、生物化工及医药行业中具有很大的应用潜力。
公开号为CN102321647A的中国专利介绍了一种β-葡萄糖苷酶、编码基因、载体、工程菌及其应用，公开了一种葡萄糖苷酶、编码基因、载体、工程菌及葡萄糖苷酶水解虎杖苷制备白藜芦醇的应用，所述β -葡萄糖苷酶基因具有与SEQ ID NO 2所示的多核苷酸序列70-100%的同源性，所述β-葡萄糖苷酶基因编码的葡萄糖苷酶具有与SEQ ID NO :1所示氨基酸序列95% -100%的同源性；本发明β _葡萄糖苷酶能够水解虎杖苷制备白藜芦醇，环境友好，产率高，应用前景广阔。
公开号为CN101845426A的中国专利介绍了一种黑翅土白蚁β-葡萄糖苷酶、编码基因、载体及应用，提供了一种黑翅土白蚁葡萄糖苷酶、编码基因、载体及应用。所述β-葡萄糖苷酶具有与SEQ ID NO :2所示多肽同源性95%以上的氨基酸序列。本发明发现了一种编码黑翅土白蚁β_葡萄糖苷酶的基因，该基因可在宿主细胞中大量表达以生产该β_葡萄糖苷酶，用于纤维素的降解，经检测本发明β_葡萄糖苷酶酶活达117U。本发明所提供的β_葡萄糖苷酶及其编码基因可应用于纤维素的降解。
而针对纯培养技术未能涉及的另一巨大的微生物资源库——未培养微生物，自从上世纪90年代末就吸引了越来越多研究者的目光。近年来通过宏基因组学技术，以获得目的基因的方法已日趋成熟，在以草食性动物消化道系统未培养微生物为对象的研究中，新的有关纤维素降解功能基因的发现层出不穷。郭宏等构建了水牛瘤胃总微生物的宏基因组文库，筛选得到一个具有β_葡萄糖苷酶活性的克隆。马淑华从兔盲肠微生物宏基因组文库中得到一个具有葡萄糖苷酶，全长为282 bp的核苷酸序列编码，其GC含量为60. 3%，编码93个氨基酸。赵广存通过构建牛瘤胃宏基因组文库，筛选得到10个具有β-葡萄糖苷酶活性以及10个具有β -I, 4-内切葡聚糖酶活性的克隆。
本发明以芒草驯养牛瘤胃未培养微生物作为研究对象，因芒草茎杆中纤维素和半纤维的含量高达80%，故经芒草驯养的牛瘤胃微生物具有更高的可获得纤维素降解酶的潜力。通过对其瘤胃微生物多样性分析发现，芒草驯养后牛瘤胃细菌中BacteiOidetes的比例从16. 33%提高到28. 15%，同时，在Firmicutes门，经芒草驯养的牛瘤胃细菌文库的比对信息中出现了 Ruminococcus fIavefaciens 和 Butyrivibrio fibrisolvens,这几种细菌均是主要的纤维素降解菌，它们可以分泌大量的纤维素酶和半纤维素酶，促进宿主的食物消化和营养能量的吸收。我们进一步通过研究从芒草驯养牛瘤胃未培养微生物的宏基因组DNA文库中发现了新的具有β -葡萄糖苷酶活性的基因，这将极大的促进纤维素资源的降解利用，对缓解世界范围内的能源紧张起到巨大的推动作用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种具有高酶活力的葡萄糖苷酶基因·(Unglul35B12)，是通过构建芒草驯养牛瘤胃未培养微生物宏基因组DNA文库和文库克隆的β-葡萄糖苷酶活性检测筛选法获得，以此为β-葡萄糖苷酶的生产提供一条新的途径和方法。
为解决上述技术问题，本发明提供了一种编码葡萄糖苷酶的基因，名称为Unglul35B12，来源于芒草驯养牛瘤胃未培养微生物，是下列核苷酸序列之一
I)序列表中SEQ ID No: I的DNA序列及其部分序列；
2)与序列表中SEQ ID No: I限定的DNA序列具有80%以上同源性的DNA序列。
序列表中SEQ ID No: I的DNA是克隆载体pUC19部分DNA序列和克隆在该载体上的外源未培养微生物的DNA，该外源DNA片段由3470个碱基组成，重组质粒携带的外源DNA片段中包含完整的新基因Unglul35B12，该基因长2340 bp, GC含量为61. 15%。
序列从序列表中的SEQ ID No: I的DNA从5’端第700位核苷酸开始到3039位核苷酸结束，存在一个完整的开放阅读框(ORF，Open Reading Frame)。其中，自5’端的第700位至702位核苷酸为Unglul35B12的起始密码子ATG，自5’端的第3037位至3039位核苷酸为Unglul35B12的终止密码子TAG。
开放阅读框共2340个核苷酸，可编码序列SEQ ID No:2中780个氨基酸组成的蛋白质。
本发·明提供了一种葡萄糖苷酶的氨基酸序列，名称为SEQ ID Νο:2，来源于芒草驯养牛瘤胃未培养微生物，是下列氨基酸序列之一
I)与序列表中SEQ ID No:2限定的氨基酸序列具有60%以上同源性的氨基酸序列。
2)与序列表中SEQ ID No:3限定的氨基酸序列具有60%以上同源性的氨基酸序列。
3)与序列表中SEQ ID Νο:4限定的氨基酸序列具有60%以上同源性的氨基酸序列。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种葡萄糖苷酶基因的克隆方法，包括以下步骤
(I)从芒草驯养牛瘤胃内容物中直接提取未培养微生物的宏基因组DNA ；
(2)构建芒草驯养牛瘤胃未培养微生物宏基因组DNA文库；
(3)从芒草驯养牛瘤胃未培养微生物宏基因组DNA文库中筛选表达β -葡萄糖苷酶的克隆；
(4) β -葡萄糖苷酶基因的克隆及表达分析。
步骤⑴包括
(1-1)从芒草驯养牛瘤胃内容物样品中直接抽提宏基因组DNA;
(1-2)采取脉冲场电泳和电洗脱法回收纯化粗制宏基因组DNA。
步骤⑵包括
(2-1)将回收的DNA连接到pcc2F0S vector上，包装，转导至ΕΡΙ300宿主细胞中，构建成Fosmid文库；
(2-2)检测Fosmid文库的覆盖度
步骤(3)包括
(3-1)获得具有β -葡萄糖苷酶活性的克隆；
(3-2)酶切插入片段，回收1-5 kb长度的DNA片段；
(3-3)以pUC19为载体构建亚克隆文库，并用β _葡萄糖苷酶活性检测筛选进行活性克隆的筛选。
步骤⑷包括
(4-1)获得表达Unglul35B12基因的阳性克隆；
(4-2)设计合适特异引物，用PCR的方法扩增Unglul35B12基因；
(4-3)用合适的限制性内切酶酶切PCR产物和表达载体pET28a(+)，酶切回收产物连接，得到重组质粒PET135B12。
基因克隆的步骤还包括对重组质粒pET135B12表达的β -葡萄糖苷酶基因进行测序和分析，对重组质粒ΡΕΤ135Β12进行表达，对β -葡萄糖苷酶基因表达的蛋白质Unglul35B12的氨基酸序列进行分析。并且初步进行了该β _葡萄糖苷酶酶学性质的研究，包括温度、pH对酶活力的影响。
在一个具体实施中，重组表达载体所用宿主细胞可以是重组表达载体中的任意一种。
在一个具体实施中，Unglul35B12基因可应用于纤维素降解生产方面。
本发明通过构建芒草驯养牛瘤胃未培养微生物宏基因组DNA文库和文库克隆的β -葡萄糖苷酶活性检测筛选法，得到新的β -葡萄糖苷酶基因，可在宿主细胞中大量表达该基因以生产葡萄糖苷酶，酶学性质研究发现该葡萄糖苷酶对pH的适应范围较宽，因此更利于工业生产过程的应用，为推动纤维素资源利用开辟了一条新的途径。
图I为从芒草驯养牛瘤胃内容物样品中直接提取未培养微生物的宏基因组DNA及电洗脱回收用于Fosmid文库构建的DNA，其中I :电洗脱回收的DNA ；2 :粗提DNA ；M =LambdaMix Marker 19。
图2为芒草驯养牛瘤胃未培养微生物宏基因组文库克隆的限制性内切酶EcoR I与Hind III酶切分析以判断文库质量，其中 10 : λ/Hind III digestive marker ;1_9及11-17 :文库克隆质粒酶切谱带。
图3为芒草驯养牛瘤胃未培养微生物宏基因组文库克隆的筛选；
图4为亚克隆文库的筛选；
图5为Unglul35B12基因DNA序列分析图；
图6为重组质粒pET135B12经EcoR I、Not I酶切带型，其中M : λ/Hind IIIdigestive marker ；1 :空载体酶切谱带；2 :重组质粒pET135B12酶切谱带。
图7为验证重组质粒pET135B12携带的Unglul35B12基因转化大肠杆菌E. coliBL21后得到的转化子依然具有β -葡萄糖苷酶活性；
图8为温度对该β -葡萄糖苷酶活力的影响；
图9为pH对该β -葡萄糖苷酶活力的影响。
具体实施方式
本发明提供的一种编码β -葡萄糖苷酶的基因，名称为Unglul35B12，是下列核苷酸序列之一
I)序列表中序列I的DNA序列及其部分序列；
2)与序列表中序列I限定的DNA序列具有80%以上同源性的DNA序列。
本发明提供的Unglul35B12基因是通过以下克隆方法的步骤获得的
(I)从芒草驯养牛瘤胃内容物中直接提取未培养微生物的宏基因组DNA ;
(2)构建芒草驯养牛瘤胃未培养微生物宏基因组DNA文库；
(3)从芒草驯养牛瘤胃未培养微生物宏基因组DNA文库中筛选表达β-葡萄糖苷酶的克隆；
(4) 葡萄糖苷酶基因的克隆及表达分析。
以下将通过实施例和附图详细解释本发明的技术方案。在本发明实施例中所用到的主要材料包括限制性内切酶EcoR I和Hind III、T4 DNA连接酶、pMD_18 T载体、购自大连宝生物公司；Fosmid文库构建试剂盒、高拷贝诱导剂、Fosmid DNA提取试剂盒购自美国 Epicentre 公司；Lamb da Mix Marker 19 购自 Fermentas 公司。
实施例I、从芒草驯养牛瘤胃内容物中直接提取微生物宏基因组DNA。
I)从_80°C冰箱取出50g/管样品，室温解冻，放入250 mL三角瓶，并加入50粒直径50 mm的玻璃珠，向三角瓶中倒入已灭菌的磷酸缓冲液100 mL,200 rpm震荡15 min,静置I min，取悬浮液置于灭菌50 mL离心管中，500 g离心3 min，将上清液转移到另一离心管，再次8000 g离心10 min，收集菌体，用此样品进行总DNA的提取。2)向沉淀的菌体加入 6. 3 mL 提取缓冲液(Sodium Phosphate :100 mmol/L, pH8. 0 ；Tris-HCl 100 mmol/L, pH 8. 0 ；EDTA 100 mmol/L,pH 8. 0 ；NaCl: :1.5 mol/L ；CTAB 2%)，反复吹打充分悬浮菌体，加入2%酸洗PVPP，100 μ L溶菌酶(10 mg/mL)，充分涡旋；
3) 37 O 水浴 30 min ；
4)加入蛋白酶 K (20mg/mL) 50 μ L，37°C水浴 30 min ;
5)加入 0. 7 mL SDS (20%，w/v)，65°C水浴 90 min，每隔 10-15 min 颠倒一次；
6) 8000 g离心15 min,吸出上清液；
7)剩余沉淀再次加入2. 7 mL提取缓冲液和0.3 mL 20%的SDS，65°C水浴10 min ；
8) 8000 g离心15 min，吸出上清液与5中上清液合并；
9)加入等体积的氯仿-异戊醇(24:1)溶液，8000g离心15 min，吸出上层水相；
10)重复上个步骤；
11)向上清液加入0. 6倍体积的异丙醇，室温放置I h ；
12)常温下，12000 g 离心 20 min,收集 DNA ；
13) 75%乙醇溶液洗涤2遍，室温晾干，加水溶解。
实施例2、采用脉冲场电泳和电洗脱法纯化粗提宏基因组DNA
I)脉冲场电泳
①将DNA样品制成低熔点琼脂糖凝胶的包埋块，4°C放置45 min方可上样；
②脉冲场电泳凝胶的配置
a. I g琼脂糖加入100 ml 0· 5XTBE，配置1%琼脂糖凝胶；
b.彻底清洗制胶槽、梳子，吹干；
c.充分溶解琼脂糖，冷却至50°C左右，灌胶，插好梳子，室温放置至少45 min可使用。
③封胶
将①中制备的包埋块放入梳孔中，用少量的液态琼脂糖封口，室温放置5 min左右，即可开始电泳。
④电泳槽和恒温系统的准备
a.向电泳槽中倒入2 L左右的0. 5 X TBE ；
b.打开低温循环水浴，设定温度12°C，待电泳槽内缓冲液温度保持在12°C即可开始电泳；
c.设定脉冲场电泳条件，时间15 h,脉冲范围1-12 s,电压4. 5 V/cm。
注意观察整个电泳过程温度必须维持在15°C以下。[0102]2)电洗脱纯化DNA
a.取长 10-20 cm 长的透析袋，在 2% NaHCO3,1 mM EDTA (pH 8. O)溶液中煮沸 10min，蒸馏水彻底冲洗；再次于I mM EDTA溶液煮沸10 min,自然冷却，浸泡于I mM EDTA溶液，4°C贮存，直至使用。使用前，取出透析袋用蒸馏水反复冲洗其内外壁；
b.透析袋一端用透析袋夹封口，注满I X TAE，将切下的胶条小心装入上述处理好的透析袋中，挤出大部分缓冲液，但剩余液体要始终包围凝胶块，取另一透析袋夹夹紧，注意不要残留气泡；
c.透析袋置于电泳槽中，设置电压为4 V/cm，时间3 h，使DNA结合在透析袋内壁；倒转电流电泳I min，DNA进入袋内缓冲液。打开透析袋一端，吸出袋内所有液体，转移至一无菌离心管中，再次用缓冲液洗透析袋，收集到同一离心管中。
请参见图1，其中泳道I是电洗脱回收的DNA，2为粗提宏基因组DNA，M为LambdaMix Marker 19。
实施例3、芒草驯养牛瘤胃未培养微生物宏基因组文库的构建
选用Epicentre公司Fosmid文库构建试剂盒进行宏基因组文库的构建
I)宏基因组DNA的准备用I mL注射器反复吹吸纯化好的高分子量DNA，将经过注射器打断20次，50次，100次的产物分别在O. 8%的琼脂糖凝胶上电泳，与control DNA和Mix Marker进行比较,选取大小最接近40 kb的DNA进行文库的构建。
2)按照如下体系进行插入DNA的末端修复
权利要求
1.一种编码β-葡萄糖苷酶的基因其核苷酸序列从序列表中的SEQID No: I的5’端第700位核苷酸开始到3039位核苷酸结束；其中，起始密码子ATG为自5’端的第700位至702位核苷酸，终止密码子TAG为自5’端的第3037位至3039位核苷酸；所述基因Unglul35B12的GC含量为61. 15%。
2.一种编码葡萄糖苷酶基因，其特征在于为下述核苷酸序列之一的基因
(1)SEQ ID No: I ; (2)与SEQID No: I限定的核苷酸序列具有80%以上同源性的核苷酸序列； (3)在高严谨条件下可与SEQID No: I限定的DNA序列杂交的核苷酸序列； (4)在高严谨条件下可与SEQID No: I限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
3.—种葡萄糖苷酶的氨基酸序列，其特征在于为下述氨基酸序列之一的氨基酸
(1)SEQ ID No: 3 或 SEQ ID No: 4 ; (2)与SEQID No: 3或SEQ ID No:4限定的氨基酸序列具有60%以上同源性的氨基酸序列。
4.根据权利要求
I的方法，重组表达载体所用宿主细胞可以是重组表达载体中的任意一种。
5.根据权利要求
I的方法，基因可应用于纤维素降解生产方面。
专利摘要
本发明提供一种编码β-葡萄糖苷酶的基因，名称为Unglu135B12，是通过构建芒草驯养牛瘤胃未培养微生物宏基因组DNA文库和文库克隆的β-葡萄糖苷酶活性检测筛选法获得，是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列及其部分序列；2)与序列表中序列1限定的DNA序列具有80%以上同源性的DNA序列。序列表中序列1的DNA是克隆载体pUC19部分DNA序列和克隆在该载体上的外源未培养微生物的DNA，该外源DNA片段由3470个碱基组成，包含基因Unglu135B12长2340bp，该基因的GC含量为61.15%。该基因用于生产β-葡萄糖苷酶。本发明亦提供Unglu135B12编码氨基酸序列1)序列表中序列2的氨基酸序列；2)与序列表中序列2限定的氨基酸序列具有80%以上同源性的氨基酸序列。该β-葡萄糖苷酶具有很好的稳定性，具有应用降解纤维素工业生产。
文档编号C12N9/42GKCN102925469SQ201210347203
公开日2013年2月13日 申请日期2012年9月18日
发明者田云, 卢向阳, 李亚丹 申请人:湖南农业大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan