的摇床中培养至桃胶溶解；第四次驯化，培养基为含有8%桃胶的LB培养 基（500mL三角瓶装液量为150mL)，接入第三次驯化液20mL，于180rpm、30°C的摇床中培 养至桃胶溶解；第五次驯化，培养基为含有10 %桃胶的LB培养基（500mL三角瓶装液量为 150mL)，接入第四次驯化液20mL，于180rpm、30°C的摇床中培养至桃胶溶解，这部分的菌液 将作为摇瓶发酵培养的种子液。
[0052](2)摇瓶发酵培养：将第五次驯化好的菌液作为种子液，种子液100ml(10%接种 量）接入到1L发酵培养基（初始pH为6、含有质量百分比6%桃胶的LB培养基）中，随后 将其置于180rpm、30°C的摇床中培养，待培养基中的桃胶完全溶解时结束发酵。
[0053] (3)离心分离去除菌体与杂质：将培养好的发酵液分装到离心管中，置于高速冷 冻离心机内，离心的条件为4°C下lOOOOrpm离心20min，去除菌体与固体杂质保留上清，将 上清混合再次以同样的离心条件离心，保留上清。
[0054] (4)饱和硫酸铵沉淀：在冰浴条件下边搅拌（速度为200rpm)边往发酵液中缓慢 地加入研磨好的硫酸铵粉末至饱和，于4°C层析柜静置过夜；离心收集沉淀，沉淀用磷酸 缓冲液（20mM、pH6. 0)复溶，随后将复溶液装入透析袋，用20mM、pH6. 0的磷酸缓冲液作为 透析液进行透析，期间更换磷酸缓冲液数次直至透析完全；透析结束后，透析液于4°C下 lOOOOrpm离心20min除去不溶杂质，收集上清液待下一步的纯化。
[0055] (5)PhenylSepharoseFastFlow疏水层析：蛋白样品的第一步纯化利用了 PhenylSepharoseFastFlow(广州浩码生物科技公司）疏水层析，整个上样过程流速控制 在1. 0ml/min，柱子规格为0丨〇X200mm层析柱，紫外检测器的检测条件为280nm，整个上 样的体积为30ml，整个纯化过程中疏水性的杂蛋白吸附在填料上，具有酶活的蛋白没有结 合在填料上，在整个上样过程中先后出现了两个穿柱峰，具有活性的蛋白存在于第二个穿 柱峰中；
[0056] (6)ToyopearlDEAE-650S离子交换层析：蛋白样品的第二步纯化采用了 ToyopearlDEAE-650S(东曹生物科技有限公司）离子交换层析，上样的流速控制在1. 0ml/ min，上样的体积为18ml，用20mmol/L磷酸缓冲液（PH6. 0)进行平衡，平衡时的流速控制在 1. 0ml/min，平衡5个柱床体积，接着用0. 6M氯化钠溶液进行洗脱，洗脱速度控制在1. 0ml/ min，洗脱下来的蛋白具有酶活。
[0057] (7)冷冻干燥：将具有活性的蛋白洗脱液装入透析袋，用20mM、pH6的磷酸缓冲液 作为透析液进行透析，透析完全后将蛋白溶液进行低温冷冻干燥，将得到的蛋白以干粉形 式进行保存。
[0058] 二、检测桃胶裂解酶的活性
[0059] (1)蛋白质量：通过该方法得到的桃胶裂解酶为11. 04±1.Omg。
[0060] (2)酶活性的检测，分别使用了下列检测方法：
[0061] ①采用郭金格、郑树朝在还原糖的测定方法的研宄中使用的DNS显色法检测还原 糖，方法如下：样品分9组分别编号为对照组1、对照组2、对照组3、反应组1、反应组2、反 应组3、反应组4、反应组5、反应组6,各组样品均为1 %桃胶液，对照组样品不加酶溶液，反 应组1、2、3、4、5、6样品分别加入等量的酶溶液；将9组样品放在恒温孵育箱内40°C孵育6 个小时；使用DNS显色法检测9组样品中的还原糖含量。
[0062] ②采用HPLC对酶解产物进行分析，具体的实施方法如下：样品分3组分别编号为 对照组1、对照组2、反应组3,对照组1为蔗糖、麦芽糖、果糖、葡萄糖和乳糖的混合样，用来 作为对照；对照组2为1 %的桃胶溶液、反应组3为1 %的桃胶溶液和酶溶液的混合液；3组 样品在恒温孵育箱内40°C孵育6个小时；之后进行高效液相色谱测定3组样品的组分。
[0063] 色谱条件如下：分析仪器为1260UHPLC;柱温：25°C;柱子为分析柱ZORBAXNH2 ;检 测器为UV检测器；流动相为乙腈：水=70:30。
[0064] 得到的分析结果如表1和图1~3所示：
[0065] 表1DNS法检测桃胶裂解酶活性
[0066]
【主权项】
1. 一种微杆菌来源的桃胶多糖裂解酶的分离纯化方法，其特征在于包括如下步骤： (1) 菌种的驯化： ① 第一次驯化：将微杆菌A5种子液接种到含有质量百分比2%桃胶的LB培养基中，于 摇床中培养至桃胶溶解，得到第一次驯化液； ② 第二次驯化：将第一次驯化液接种到含有质量百分比4%桃胶的LB培养基中，于摇 床中培养至桃胶溶解，得到第二次驯化液； ③ 第三次驯化：将第二次驯化液接种到含有质量百分比6%桃胶的LB培养基中，于摇 床中培养至桃胶溶解，得到第三次驯化液； ④ 第四次驯化：将第三次驯化液接种到含有质量百分比8%桃胶的LB培养基中，于摇 床中培养至桃胶溶解，得到第四次驯化液； ⑤ 第五次驯化：将第四次驯化液接种到含有质量百分比10%桃胶的LB培养基中，于摇 床中培养至桃胶溶解，得到驯化好的种子液； (2) 发酵培养：将驯化好的种子液接种到发酵培养基中，于摇床中培养至桃胶完全溶 解；发酵培养基为含有质量百分比6%桃胶的LB培养基，初始pH值为6 ; (3) 分离纯化： ① 将发酵液离心，去除菌体，取上清； ② 在上清中加入硫酸铵至饱和，于4°C静置过夜；离心收集沉淀，随后用磷酸缓冲液将 沉淀复溶；接着用磷酸缓冲液进行透析，期间更换磷酸缓冲液数次直至透析完全；透析结 束后，透析液离心除去不溶杂蛋白，收集上清液待纯化； ③ 将步骤②得到的上清液上样到苯基琼脂糖凝胶6FF柱中，收集第二个穿柱峰； ④ 对第二个穿柱峰上样到Toyopearl DEAE-650S柱中，接着用磷酸缓冲液进行平衡，而 后再用〇. 6M NaCl溶液进行洗脱，收集第一个洗脱峰； ⑤ 将第一个洗脱峰透析后冻干，得到桃胶多糖裂解酶。
2. 根据权利要求1所述微杆菌来源的桃胶多糖裂解酶的分离纯化方法，其特征在于： 所述的摇床的条件设置为28~30°C、180~200rpm。
3. 根据权利要求1所述微杆菌来源的桃胶多糖裂解酶的分离纯化方法，其特征在于： 步骤（1)中所述的接种的量为体积百分比7.5% ;步骤（2)中所述的接种的量为体积百分 比 10% 〇
4. 根据权利要求1所述微杆菌来源的桃胶多糖裂解酶的分离纯化方法，其特征在于： 步骤（3)中所述的离心的条件为4°C、10000rpm离心20min。
5. 根据权利要求1所述微杆菌来源的桃胶多糖裂解酶的分离纯化方法，其特征在于： 步骤（3)②中所述的磷酸缓冲液为20mmol/L、pH6. 0的磷酸缓冲液。
6. -种微杆菌来源的桃胶多糖裂解酶，其特征在于：通过权利要求1~5任一项所述 的分离纯化方法得到。
7. 权利要求6所述微杆菌来源的桃胶多糖裂解酶在裂解桃胶中的应用。
8. 根据权利要求7所述微杆菌来源的桃胶多糖裂解酶在裂解桃胶中的应用，其特征在 于：所述的桃胶多糖裂解酶的酶解温度为30~40°C，酶解体系为pH值为5~7的磷酸缓 冲液。
9. 根据权利要求7所述微杆菌来源的桃胶多糖裂解酶在裂解桃胶中的应用，其特征在 于：所述的桃胶裂解酶的酶解温度为30°C，酶解体系为pH值为6的磷酸缓冲液。
10.根据权利要求9所述微杆菌来源的桃胶多糖裂解酶在裂解桃胶中的应用，其特征 在于：所述的桃胶裂解酶的酶解温度为30°C ;酶解体系为pH值为6的磷酸缓冲液配以ImM 的K+、Ca2+和Mn 2+中的一种或至少两种离子，或配以IOmM的Na +和Mg 2+中的一种或两种离 子。
【专利摘要】本发明公开了一种微杆菌来源的桃胶多糖裂解酶及其分离纯化方法与应用。本发明通过对微杆菌A5驯化后发酵培养，对发酵上清用硫酸铵沉淀，将沉淀物复溶后依次用苯基琼脂糖凝胶6FF柱和Toyopearl DEAE-650S柱纯化，得到微杆菌来源的桃胶多糖裂解酶。该桃胶多糖裂解酶能有效分解桃胶，因此，其能用于分解桃胶，得到功能性低聚糖。
【IPC分类】C12R1-01, C12N9-88, C12P19-00
【公开号】CN104651340
【申请号】CN201510096790
【发明人】冉艳红, 张亮, 李弘剑, 王伟, 陈文燕
【申请人】暨南大学
【公开日】2015年5月27日
【申请日】2015年3月4日