阴离子表面活性剂耐受性提高的枝孢霉脂肪酶变体的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体说涉及阴离子表面活性剂耐受性提高的枝孢霉脂 肪酶变体。
【背景技术】
[0002] 脂肪酶（lipase，EC3. 1. 1. 3)是一类特殊的酯键水解酶，广泛存在于动植物和微 生物体中。脂肪酶可以催化酯类化合物的水解、醇解、酯化、酯交换以及化合物的合成等反 应。其可应用于食品、医药、洗涤剂、纺织、生物柴油、造纸、皮革、化妆品和环境保护等多个 工业令页域（Hasan F, Ali SA, Hameed A. Industrial applications of microbial lipases. Enzyme Microb.Technol. 2006, 39:235-251.)。洗涤剂主要应用于餐具和衣物的清洗、漂 白、干洗，皮革清洁，隐形眼睛清洗，化妆品和食品加工等工业废物的清理，排气管和抽水马 桶有机废物的降解等（Enzymes used in detergents:Lipases)。在低温、弱碱性洗漆环 境下，油性污垢难以去除，在洗衣剂和餐具洗涤剂中配入分解油脂的脂肪酶，能得到比较 好的去污效果(脂肪酶在洗涤剂中的应用，坂口博修，日用化学工业译丛，1990年第2期， 11-14)。
[0003]目前商品化的脂肪酶有：诺维信公司的脂肪酶Lipolase，杰能科公司的 Lumafast,以及吉斯特-布罗卡德斯公司的Lipomax。三种商品化脂肪酶虽然在洗漆工业上 应用较广，但在阴离子和非离子表面活性剂中的耐受性较差。而表面活性剂是洗涤剂中不 可缺少的成分，对洗涤过程中污垢的去除起着至关重要的作用，其中阴离子表面活性剂是 洗涤剂中的主要成分，因此，现有的这三种商品化脂肪酶在洗涤工业上的应用受到较大限 制。
[0004] 因此，业界急需一种阴离子表面活性剂耐受性好的脂肪酶，以克服上述缺陷，提高 脂肪酶在洗涤工业上的应用。
【发明内容】
[0005] 本发明的发明人通过突变，获得了一种脂肪酶，该脂肪酶具有良好的阴离子表面 活性剂耐受性，可作为洗涤剂的酶制剂使用，具有良好的工业应用前景。
[0006] 因此，本发明的第一方面在于，提供一种具有脂肪酶活性的多肽。
[0007] 本发明提供的具有脂肪酶活性的多肽包含突变的SEQ ID N〇:42所示的氨基酸序 列或其活性片段，其中所述突变包括将SEQ ID No:42所示的氨基酸序列的第377位的赖氨 酸突变为酸性氨基酸或其酰胺。
[0008] 在本发明的一个实施方案中，将SEQ ID No:42所示的氨基酸序列的第377位的赖 氨酸突变为谷氨酸（E)、天冬氨酸（D)、谷氨酰胺（Q)或天冬酰胺（N)，优选突变为谷氨酸（E) 或天冬氨酸（D)。
[0009] 本发明的第二个方面在于，提供编码第一方面的多肽的核酸分子。
[0010] 本发明的第三个方面在于，提供包含第二方面的核酸分子的载体。
[0011] 在本发明的一个实施方案中，所述载体为表达载体。
[0012] 在本发明的一个实施方案中，所述载体被设计用于真核细胞或原核细胞中表达。 在本发明的一个实施方案中，所述载体进一步被设计用于细菌细胞、真菌细胞、酵母细胞、 哺乳动物细胞、昆虫细胞或植物细胞中表达。
[0013] 本发明的第四个方面在于，提供包含本发明第二方面的核酸分子或第三方面的载 体的细胞。
[0014] 在本发明的一个实施方案中，所述细胞为真核细胞或原核细胞。在本发明的一个 实施方案中，所述细胞为细菌细胞、真菌细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞或植物细 胞。
[0015] 本发明的第五个方面在于，提供使用本发明第四个方面的细胞产生的脂肪酶。
[0016] 本发明的第六个方面在于，提供使用本发明第四个方面的细胞产生的脂肪酶酶 液。
[0017] 在本发明的一个实施方案中，所述脂肪酶酶液为所述细胞的发酵上清。
[0018] 本发明的第七个方面在于，提供本发明的第一个方面的多肽、或第二个方面的核 酸分子编码的多肽、或第三个方面的载体编码的多肽、或第四个方面的细胞表达出的多肽、 或第五个方面的脂肪酶、或第六个方面的脂肪酶酶液用于洗涤工艺中的用途。
[0019] 本发明的第八个方面在于，提供本发明的第一个方面的多肽、或第二个方面的核 酸分子、或第三个方面的载体、或第四个方面的细胞在制备脂肪酶中的用途。
[0020] 本发明的第九个方面在于，提供一种洗涤产品，所述洗涤产品包括本发明的第一 个方面的多肽、或第二个方面的核酸分子、或第三个方面的载体、或第四个方面的细胞、或 第五个方面的脂肪酶、或第六个方面的脂肪酶酶液。
【附图说明】
[0021] 图1显示377位的不同突变的脂肪酶的SDS耐受性比较结果。
[0022] 图2显示脂肪酶突变体496和脂肪酶wt的阳离子和非离子表面活性剂耐受性比 较结果。
[0023] 图3显示脂肪酶突变体496和脂肪酶wt的LAS耐受性比较结果。
[0024] 图4显示脂肪酶突变体496和脂肪酶wt的A0S耐受性比较结果。
[0025] 图5显示脂肪酶突变体496和脂肪酶wt的AES耐受性比较结果。
[0026] 图6显示脂肪酶突变体496和脂肪酶wt的SDS耐受性比较结果。
[0027]本发明的枝孢霉（Cladosporiumsp. )WBRD3. 10062425 已于 2011 年 06 月 17 日保 藏在"中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)"（北京市朝阳区北辰西路 1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号是CGMCCNo. 4962,分类命名为： 枝抱霉Cladosporiumsp.〇
【具体实施方式】
[0028] 以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本 发明而非用于限定本发明的范围。
[0029]在本发明中，如果没有特别的说明，百分数（％ )或者份都指相对于组合物的重量 百分数或者重量份。
[0030] 在本发明中，如果没有特别的说明，所涉及的各组分或其优选组分可以相互组合 形成新的技术方案。
[0031] 在本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有实施方式以及优选实施方 式可以相互组合形成新的技术方案。
[0032] 在本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有技术特征以及优选特征可 以相互组合形成新的技术方案。
[0033] 在本发明中，如果没有相反的说明，组合物中各组分的含量之和为100%。
[0034] 在本发明中，如果没有相反的说明，组合物中各组分的份数之和可以为100重量 份。
[0035] 在本发明中，除非有其他说明，数值范围"a-b"表示a到b之间的任意实数组合的 缩略表示，其中a和b都是实数。例如数值范围"0-5"表示本文中已经全部列出了 "0-5" 之间的全部实数，"0-5"只是这些数值组合的缩略表示。
[0036] 在本发明中，除非有其他说明，整数数值范围"a_b"表示a到b之间的任意整数组 合的缩略表示，其中a和b都是整数。例如整数数值范围"1-N"表示1、2……N，其中N是 整数。
[0037] 在本发明中，除非有其他说明，"其组合"表示所述各元件的多组分混合物，例如两 种、三种、四种以及直到最大可能的多组分混合物。
[0038] 如果没有特别指出，本说明书所用的术语"一种"指"至少一种"。
[0039] 如果没有特别指出，本发明所述的百分数(包括重量百分数）的基准都是所述组合 物的总重量。
[0040] 本文所公开的"范围"以下限和上限的形式。可以分别为一个或多个下限，和一个 或多个上限。给定范围是通过选定一个下限和一个上限进行限定的。选定的下限和上限限 定了特别范围的边界。所有可以这种方式进行限定的范围是包含和可组合的，即任何下限 可以与任何上限组合形成一个范围。例如，针对特定参数列出了 60 - 120和80 - 110的 范围，理解为60 - 110和80 - 120的范围也是预料到的。此外，如果列出的最小范围值1 和2,和如果列出了最大范围值3,4和5,则下面的范围可全部预料到：1 一3、1 一4、1 一5、 2-3、2-4、和2 - 5。
[0041] 在本文中，除非另有说明，各组分的比例或者重量都指干重。
[0042] 在本文中，除非另有说明，各反应都在常温常压下进行。
[0043] 在本文中，除非另有说明，各个反应步骤可以顺序进行，也可以不按顺序进行。例 如，各个反应步骤之间可以包含其他步骤，而且反应步骤之间也可以调换顺序。优选地，本 文中的反应方法是顺序进行的。
[0044] 在本发明的下述实施例中，脂肪酶酶活测定采用对硝基苯棕榈酸酯（p-NPP)法来 测定，该方法以对硝基苯棕榈酸酯为反应底物，通过脂肪酶的催化产生有色产物对硝基苯 酚（P-NP)，该产物在405-410nm波长下具有强烈吸收。酶活力单位定义为：1个单位即指在 标准实验条件下每分钟催化释放1Umol的p-NP所需的酶量。具体方法如下：
[0045] 预先配置底物和缓冲液，底物：6mg/mlp-NPP(异丙醇溶解)，缓冲液：0? 05mol/ ITris(pH8.0,0. 1%阿拉伯胶)。将底物和缓冲液以1:9 (v/v)配成反应混合液。取两个 2ml离心管，分别为对照管和样品管。分别添加400ul反应混合液至两离心管，在35°C预温 浴5min。向样品管中加入一定量的稀释酶液，混合均匀后，继续温浴15min。加入1. 5ml乙 醇至上述两离心管终止反应，并添加同样量的稀释酶液至对照管。12000rpm离心2min，取 上清，测405nm处的吸光值。
[0046] 根据标准曲线所得酶活计算公式为：A=- ([A1-A0]X0. 7885-0. 0118)XVIXn/ (V2Xt)。
[0047] 其中，A:样品酶活（U/ml)，Al:样品酶液的0D405，A0:对照酶液的0D405，V1:总反 应液的体积（ml)，n:酶液的稀释倍数，V2 :酶液的体积（ml)，t:反应时间（min)。
[0048] 在本发明的下述实施例中，使用的培养基为：
[0049]LB液体培养基：1%蛋白胨，0? 5%酵母提取物，1%氯化钠，调整pH至7. 0。
[0050]PDA液体培养基：20%马铃薯(切成小块，加水煮烂，用八层纱布过滤，收集液体)， 2%葡萄糖，自然