用食用菌菌棒生产木质素酶的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及木质素酶的生产方法，尤其涉及一种以食用菌菌棒为原料生产木质素酶的方法。
技术背景
[0002]木质素酶(Lignin-degrading enzymes)，是能够催化木质素氧化降解的一组酶的总称，包括漆酶(简称Lac)、锰过氧化物酶(简称Mnp)和木质素过氧化物酶(简称Lip)。漆酶即系统名为本二酚氧化还原酶，作用与邻酮醇和对酮醇，氨基苯酚和本二胺的氧化反应；锰过氧化物酶即系统名为二价锰过氧化氢氧化还原酶，催化二价锰氧化成三价锰的反应；木质素过氧化物酶即系统名为木质素过氧化氢氧化还原酶，催化木质素的氧化反应。研宄发现，它们对许多含有芳香结构的化合物如多环芳烃、酚类、氯代芳香化合物、染料、农药等污染物都有较强的降解能力，这是由于食用菌分泌产生的木质素降解酶系底物的非专一性决定的。并且降解酶系为胞外分泌，从而更加容易接触这些待降解物。这种特殊的降解机制在环境保护、饲料工业、化学工业和煤炭化学方面展现了巨大的应用前景，已经引起了学术界和工业界的广泛关注。
[0003]目前木质素酶的生产大多采用液态深层发酵生产，技术要求苛刻，能耗高，酶活低并且还会产生大量的生产废水，对环境产生不良影响。近年来，各国研宄人员逐渐开始用固态发酵技术生产木质素酶，它可模仿天然微生物的生长过程，生产人们需要的产品，但由于产木质素酶的微生物一般都是丝状真菌，生长速度较慢，故生产周期较长。也有研宄报道直接从食用菌菌渣中提取木质素酶，但由于未加产酶诱导液培养的菌渣中木质素酶酶活较低，需要很高的分离纯化成本，经济效益较低，不利于大规模应用。
[0004]到目前为止，尚未见任何以食用菌菌棒为原料添加产酶诱导液进行二次培养生产木质素酶的技术。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种用食用菌菌棒生产木质素酶的方法，利用含有食用菌菌丝的菌棒为原料，使得农业生产中的菌棒得到高值化再利用，改善环境，降低木质素酶制取的成本。
[0006]菌棒是指以棉籽壳、木肩、稻草、玉米芯、甘蔗渣及多种农作物秸杆、工业废料为主要原料，接种食用菌菌丝培养一段时间以后用来生产食用菌子实体或采收子实体以后剩下的棒状固态混合物。食用菌菌丝在培养基中生长时，需要产生大量的木质素酶来分解基质中的木质纤维素以获得营养。因此，收获或者尚未收获子实体的菌棒中含有大量的食用菌菌丝和木质纤维素。菌棒的具体组成不能作为对本发明所述木质素酶制备方法的限定。
[0007]工业废料主要选自于醋糟、酒糟、造纸厂废液。
[0008]食用菌为人工培养或野生环境下可为生物食用的菌类。其生长过程中能分泌木质素酶来分解基质中的木质纤维素以获得营养。所述食用菌主要选自于蘑菇(Agaricuscampestris)、香葫(Lentinula edodes)、茶树葫(Agrocybe aegerita)、猴头葫(Hericiumerinaceum)、凤尾葫(Pleurotus sajor-caju)、双抱蘑葫(Agaricus bisporus)、木耳(Auricularia auricula)、冬虫夏草(Cordyceps sinensis)、灵芝(Ganoderma lucidum)、血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus)、金耳(Tremella aurantialba)、鲍鱼葫(Pleurotusabalonus)、平葫(Pleurotus ostreatus)、金针葫(Flammulina velutipes)、杏鲍葫(Pleurotus eryngii)、秀珍葫(Pleurotus geesteranus)、鸡腿葫(Coprinus comatus)、白灵葫(Pleurotus nebrodensis)、肺形侧耳(Pleurotus pulmonarius)、姬松鸾(Agaricusblazei)等。
[0009]本发明提供了一种利用食用菌菌棒生产木质素酶的方法，具体包括如下步骤:菌棒的破碎处理得到菌糠；添加产酶诱导液；适宜条件下培养；粗酶液回收；多次添加诱导液产酶。
[0010]1.破碎菌棒得到菌糠
[0011]将已经或者尚未采收子实体的菌棒除去塑料袋以后，利用粉碎机将菌棒破碎得到均匀的菌糠。
[0012]2.添加诱导产酶液
[0013]所用诱导产酶液含有木质素酶的诱导物，其他物质能为食用菌菌丝提供氮元素和微量元素，此外还能调整体系的碳氮比(C/N)和pH值，刺激菌丝二次生长。诱导产酶液通过本实验室长期反复试验得到。
[0014]—种具体的实施方式，每1kg菌糠诱导产酶液的通常加入量为10-50L，可进一步选择10-30L，当具体选择12、13、15、16、17、19、20、23、25或28L时能更有效地刺激菌糠中食用菌菌丝的二次生长，诱导木质素酶的高效表达和分泌。
[0015]3.适宜条件下培养
[0016]合适的外界培养条件可以改变食用菌菌丝的生理状态，更好地表达和分泌木质酶。
[0017]一种具体的实施方式，培养温度通常为17-35°C，可进一步选择为22-30°C，或具体选择为22、24、25、27、28、30°C。在以上温度条件下培养的时间为24-192小时，或进一步选择24、72、96、120或144小时，可以得到木质素酶含量更高的菌糠。
[0018]4.粗酶液的回收
[0019]向步骤3得到的含有大量木质素酶的发酵熟成体系中加入1-20倍体积的蒸馏水浸泡，振荡，过滤。可进一步选择1-10，当具体选择为1、3、5、7、9倍时能使菌丝分泌的木质素酶尽可能地溶解到溶液中又不伤害到菌丝。当蒸馏水体积过少得到的木质素酶总量就会过少，当蒸馏水体积过大，就会在洗脱过程中使菌丝受到损害。
[0020]5.多次添加产酶诱导液
[0021]向步骤3得到的菌糠交替重复步骤2添加产酶诱导液、步骤3适宜条件下培养、步骤4粗酶液的回收，共计1-6个周期，这样做的目的是更高效地利用菌糠。重复次数过多以后由于菌丝的老化，产酶能力下降。
[0022]本发明提供了一种利用食用菌菌棒生产木质素酶的方法。是菌糠高值化利用的一种新途径，是一种全新的木质素酶生产方法，与目前所有报道过的有关木质素酶生产方法相比，本发明省去了食用菌菌体生长过程，缩短了产酶时间，节约了能源和材料，是所有已经报道过的有关木质素酶生产方法中成本最低的。因此，利用废弃菌糠制备木质素酶，既可以做到废物利用改善环境，又可以降低木质素酶的生产成本，具有很好的应用前景。
【具体实施方式】
[0023]以下结合实例详细描述本发明的技术方案。实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应