一种自然pH发酵木质纤维素产乙醇的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物发酵领域，具体涉及一种自然pH发酵木质纤维素产乙醇的方 法。
【背景技术】
[0002] 诸多如石油等不可再生的化石能源日益枯竭，使得可再生能源特别是生物燃料受 到越来越多的关注，并带来巨大的商机和社会意义。
[0003] 乙醇是清洁的可再生液体燃料，许多国家已经开始使用添加了一定比例乙醇的汽 油一汽油醇，以代替汽油的消耗。这种新型燃料既能缓解石油的消耗速率，又可以减少汽车 尾气污染，具有极大的应用和发展潜力。我国从2001年起开始推广使用汽油醇，目前汽油 醇占汽油类燃料总消耗量的约20%，并处于逐年增长的势头。
[0004]目前国内外生产乙醇所使用的主要原料是玉米等粮食作物。随着世界人口的不断 增长，粮食日益短缺，因此从长远来看，粮食作物不是生产乙醇的理想原料。
[0005] 生物质能源是未来能源领域中一种重要的可再生能源。近年来，世界各国都在大 力开发综合利用生物质的相关技术，并在利用生物质生产燃料乙醇、生物柴油、生物氢气、 生物沼气等方面取得了一定的成果，今后生物质能源的相关技术仍是各国研究与开发的热 点。我国具有丰富的生物质资源，据统计，我国每年仅秸杆的产量即可达7亿吨，这之中蕴 藏了极为可观的生物质能源，仍需进一步的开发与利用。
[0006]目前，采用生物质发酵的方式生产乙醇的相关技术，即将生物质中的木质纤维素 发酵，进而生产乙醇的相关技术，已形成了一定的产业化规模。但普遍存在以下问题：1)为 使发酵菌株处于最适pH环境中，具有较强活性，以提高乙醇的产量，发酵过程中不得不加 入适量的碱对发酵液的pH进行实时调节，这不仅使得发酵过程中的操作变得复杂，而且极 易因为调控的误差影响发酵产率，并且在加入碱的环境下，有利于乳酸菌等杂菌的生长，容 易造成发酵体系中杂菌的含量偏高。
【发明内容】
[0007] 为此，本发明所要解决的技术问题是提供一种发酵过程中无需调节pH的发酵木 质纤维素产乙醇的方法。
[0008] 本发明的自然pH发酵木质纤维素产乙醇的方法，包括以下步骤：
[0009] 1)取Ho-Purdue酵母424A(LNH-ST)菌株进行扩大培养；
[0010] 2)取含木质纤维素原料进行酶解，得到含木质纤维素原料酶解液的发酵培养基；
[0011] 3)将经过步骤1)扩大培养后的菌种接种至步骤2)中得到的发酵培养基中，控制 温度28-35°C，转速50-100rpm/min，自然pH，发酵24-72h得到发酵液；
[0012] 4)分离提取步骤3)的发酵液中的乙醇，即得。
[0013] 其中，所述Ho-Purdue酵母424A(LNH-ST)为美国绿色科技公司（GreenTech America，Inc)购得。
[0014]所述步骤1)中，所述扩大培养的步骤的培养条件具体为：控制扩大培养基的pH值 4-6,扩培温度 28-35°C，转速 100-200rpm/min。
[0015]所述步骤1)中，所述扩大培养步骤所选用的扩大培养基中包括重量百分含量为 2-10%的葡萄糖以及重量百分含量为1-6%的木糖。优选的，所述的扩大培养的培养基中葡 萄糖的含量以重量百分比计含量为4-6%，木糖含量1-4%。
[0016]所述扩大培养基中还包括玉米糖化醪、糖蜜、甜高粱茎杆汁中的一种或几种为碳 源，黄豆饼粉、玉米饼粉、玉米浆、鱼粉、蛋白胨、酵母膏中的一种或几种为氮源。
[0017] 所述的扩大培养基中还包括含量为2_5g/L的尿素和/或含量为0. 5_4g/L的无机 盐。其中，所述的无机盐为磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸氢二铵 中的一种或几种。优选的，所述扩大培养的培养基中，含有所述的无机盐磷酸二氢钾1.5g/ L和磷酸氢二铵1. 5g/L。
[0018] 进一步的，所述扩大培养为接种量5%-20%接种扩大培养至（0. 2-0. 3)X109/ml。 [0019]所述步骤2)中，所述含木质纤维素原料酶解的步骤具体为：向所述含木质纤维素 原料中加入100_200fpu滤纸酶活力单位的酶，在40-60°C下保温混合48-96h，得到糖浓度 为8-16%的木质纤维素原料酶解液，并调节酶解液的pH至4-6。
[0020] 所述含木质纤维素原料选自玉米秸杆、玉米芯、硬木、软木、坚果壳、草、纸、大麦 杆、小麦杆、树叶、棉籽絮、报纸、柳枝或燕麦壳。
[0021] 从结构上看，木质纤维素主要包括纤维素、半纤维素和木质素。在优选实施方案 中，含木素纤维素原料包含至少30wt%，优选至少50wt%，更优选至少70wt%，甚至更优选 至少90wt%的木质纤维素。应理解的是，含木质纤维素原料中还可以包含其它组分，如蛋白 质材料、淀粉、糖，如可发酵的糖和/或不可发酵的糖。优选的，本发明中所指含木质纤维素 原料为玉米秸杆。
[0022] 所述酶选自纤维素酶、半纤维素酶，淀粉酶、蛋白酶、葡糖淀粉酶或脂肪酶。其中， 纤维素酶包括但不限于纤维二糖水解酶(纤维二糖水解酶I和纤维二糖水解酶II)以及内 切葡聚糖和葡糖苷酶。
[0023] 所述含木质纤维素原料酶解液中还包括工作浓度为2-20单位/mL的抑制剂；所述 抑制剂为青霉素、氨节青霉素、链霉素、氯霉素、土霉素、四环素中的一种或几种。
[0024] 所述含木质纤维素原料酶解液中还含有2_5g/L的尿素及0.5_4g/L的无机盐。
[0025] 优选的，在步骤2)中所述木质纤维原料酶解前，对所述木质纤维素原料采用本领 域常用的蒸煮法、酸浸法、碱处理、蒸汽爆破、胶体磨粉碎中的一种或多种进行预处理。
[0026] 所述步骤3)中，将经过步骤1)扩大培养后的菌种接种至步骤2)中得到的发酵培 养基中，其接种量为5-20%。
[0027] 所述步骤1)中，还包括在所述扩大培养步骤前将所述菌种进行种子液培养的步 骤，所用种子液培养步骤条件为：控制pH值4-6,培养温度28-35°C，转速100-200rpm/min。
[0028] 所述种子液培养步骤的种子液培养基包括酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖 20g/L。所述种子液培养基为酵母粉、蛋白胨、葡萄糖，经分装灭菌后混合制备得到。
[0029] 进一步的，所述种子液培养为：将所述Ho-Purdue酵母424A(LNH-ST)菌株采用所 述种子液培养基培养至（〇. 1-0. 5)X109/ml。
[0030] 本发明的上述技术方案，相比现有技术具有以下优点：
[0031] (1)本发明所述的发酵产乙醇的方法，通过选用特定的菌株对含木质纤维素原料 酶解液进行发酵产乙醇，整个发酵过程中发酵液的pH的变化对所述菌株的活性影响较小， 可实现在不调节发酵液的自然pH的情况下进行乙醇的发酵，并实现了较高的乙醇产量，避 免了在发酵过程中需要不断添加碱带来的复杂操作及对产物的抑制；同时，由于发酵过程 中pH相对较低，抑制了乳酸菌等杂菌的生长，经实验测定，发酵液中杂菌产生的乳酸、乙酸 等的浓度明显较低；
[0032] (2)本发明所述的发酵产乙醇的方法，采用选定的含C5和C6为碳源的扩大培养基 进行特定菌种的特定诱导培养，使得所述菌种保持了较好的发酵活力，不仅实现了自然pH 的发酵，同时菌种的发酵性能较好。
【具体实施方式】
[0033] 实施例1
[0034] 本实施例的自然pH发酵木质纤维素产乙醇的方法，包括以下步骤：
[0035] 1)取所述Ho-Purdue酵母424A(LNH-ST)菌株进行种子培养、扩大培养；其培育 过程具体为：
[0036] 种子培养：将酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L经分装灭菌后混合制备得 到种子液培养基，将所述Ho-Purdue酵母424A(LNH-ST)菌株接种至所述培养基，培养20h 至菌种浓度达到（〇. 2-0. 3 )X109/ml。
[0037] 扩大培养：取所述种子培养中得到的菌体，按接种量5%接种到含有扩培培养基的 摇瓶中，扩培温度30°C，转速200rpm，培养时间16h，第一级菌体5%接种至第二级扩培培养 基培养，调节pH值为5,扩培温度30°C，转速200rpm，扩培16h，扩大培养至（0. 2-0. 3)X109/ ml〇
[0038] 所述扩大培养的培养基为2%葡萄糖、6%木糖的扩培培养基，含有葡萄糖2% (质量百分比)、木糖6% (质量百分比)、玉米浆(干物质含量40%) 15g/L、KH2P041.5g/L、 (NH4)2HP041. 5g/L;去离子水或软化水配置溶液，调pH6. 0,分装灭菌，冷却后混合，加入3g/ L尿素。
[0039] 2)向所述木质纤维素原料中加入200fpu滤纸酶活力单位的纤维素酶，在50°C下 保温混合72h，得到糖浓度为8%的木质纤维素原料酶解液，调节pH至5. 0 ;其中，所述木质 纤维素原料为玉米秸杆。
[0040] 3)取所述扩大培养中得到的菌株，以10%的接种量接种至步骤2)中得到的所述木 质纤维素原料酶解液中，温度保持在30°C，摇瓶转速75rpm/min，自然pH值，发酵72h。
[0041] 4)分离步骤3)的发酵液中的乙醇，即得。
[0042] 实施例2
[0043] 本实施例的自然pH发酵木质纤维素产乙醇的方法，包括以下步骤：
[0044] 1)取所述Ho-Purdue酵母424A(LNH-ST)菌株进行种子培养、扩大培养；其培育 过程具体为：
[0045] 种子培养：将酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L经分装灭菌后混合制备 得到种子液培养基，将所述Ho-Purdue酵母424A(LNH-ST)菌株接种至所述培养基，30°C、 pH6. 0培养至菌种浓度达到（0. 1-0. 2 )X109/ml。
[0046] 扩大培养：取所述种子培养中得到的菌体，按接种量20%接种到含有扩培培 养基的摇瓶中，调节pH值为4,扩培温度35°C，转速lOOrpm，培养时间14h，扩大培养至 (0? 2-0. 3)X109/ml。
[0047] 所述扩大培养的培养基为按重量百分比含有葡萄糖10%、木糖1%的甜高粱茎杆 汁，玉米饼粉5g/L，磷酸二氢钾4g/L;去离子水或软化水配置溶液，分装灭菌，冷却后混合， 加入2g/L尿素。
[0048] 2)向所述木质纤维素原料中加入lOOfpu滤纸酶活力单位的淀粉酶，及工作浓度 为2单位/mL的四环