用于递送生物活性材料的支化聚胺的制作方法
【专利说明】用于递送生物活性材料的支化聚胺
[0001] 联合研发协议的各方
[0002] 本发明是在InternationalBusinessMachinesCorporation和theAgencyFor Science，TechnologyandResearch的联合研发协议下做出的。
[0003] 背景
[0004] 本发明涉及用于递送生物活性材料的支化聚胺，更具体地，涉及氨基甲酸酯官能 化的支化聚乙烯亚胺，其包含用于基因递送的疏水氨基甲酸酯端基。
[0005] 基于核酸的疗法在治疗人类疾病上大有前景。理论上，不仅错误和缺陷基因可以 被功能基因修正和替换，而且多余的基因表达也可以通过使用RNA干预而被抑制到正常水 平。通常，有两个主要类型的基因递送载体，即病毒载体和非病毒载体。尽管病毒载体具有 优越的转导能力，但是病毒载体的致免疫和致癌的可能性限制了其临床应用。为了避免这 个问题，已经报道了一些非病毒基因递送系统，其包括（1)核酸与包括脂类、聚合物和肽在 内的多种阳离子分子的络合以及（2)核酸与诸如胆固醇和细胞穿透肽的天然配体的结合。 非病毒基因递送载体正在受到更多的关注，这是由于其生物安全性、低生产成本、运输和储 存方便、再生产性，以及用于靶向特定细胞类型的可调的官能性。
[0006] 在各种类型的非病毒载体中，支化聚乙烯亚胺（bPEI)，其含有伯、仲和叔胺基，提 供了高的体外基因转染效率。具体地，具有25kDa的重均分子量（Mw)和约10kDa的数均分 子量（Mn)的在本文中称为bPEI-25的bPEI被视为工业标准。bPEI-25在生理pH下具有高 阳离子电荷密度，其中bPEI-25的约20%的胺基团（即伯胺）被质子化。这使得bPEI-25能 够与带负电的核酸在宽泛的pH范围内静电相互作用并且使它们能够复合成纳米粒子。一 旦bPEI-25/核酸纳米复合物被细胞吸收同化，那么仲胺和叔胺促进核酸从核内体通过"质 子海绵效应"释放。对于脱氧核糖核酸（DNA)，所释放的核酸被摄入细胞核给予了高的基因 转移效率。
[0007] 尽管有着高的基因转染效率，bPEI-25的净正电荷具有涉及以下的主要缺点，即， 涉及毒性、聚集以及bPEI-25/核酸复合物与细胞组分和非细胞组分（尤其在体内）不期望 的非特异性相互作用。副反应包括肝坏死、聚集的血小板的粘连以及更高剂量的全身注射 之后的休克。
[0008] 考虑到bPEI-25所面临的细胞毒性问题，低分子量支化聚乙烯亚胺（Mw为约 2. 0kDa，Mn为约1. 8kDa，在本文中称为bPEI-2)也已获得关注，这是由于其有利的细胞毒性 谱。当用于体内治疗目的时，低分子量使得bPEI-2可以从肾脏排泄。然而，bPEI-2的主要 缺点是其低效的转染能力，使其不足以用作基因转染载体。
[0009] 因此，对于开发更有效且细胞毒性更低的用于递送生物活性材料的聚乙烯亚胺衍 生物，存在着持续的需求。
[0010] 概述
[0011] 因此，公开了支化聚胺，其包含：
[0012] 约45至约70个骨架叔胺基团，约90至约140个骨架仲胺基团，大于0的正数n' 个骨架末端伯胺基团，以及大于〇的正数q个通式（2)的骨架末端氨基甲酸酯基团：
【主权项】
1. 支化聚胺，其包含： 约45至约70个骨架叔胺基团，约90至约140个骨架仲胺基团，大于O的正数η'个骨 架末端伯胺基团，以及大于〇的正数q个通式（2)的骨架末端氨基甲酸酯基团： 其中：
(n' +q)为等于约45至约70的数， 通式（2)的星号键与所述支化聚胺的骨架氮连接， L'为包含3至30个碳的二价基团，以及 q/ (n，+q) X 100 % 等于约 9 % 至约 47 %。
2. 如权利要求1所述的支化聚胺，其中所述支化聚胺基本由η'个伯氮丙啶重复单元、 约90至约140个仲氮丙啶重复单元、约45至约70个叔氮丙啶重复单元以及q个通式（2) 的氨基甲酸酯基团组成。
3. 如权利要求1所述的支化聚胺，其中所述支化聚胺是数均分子量为约8500至约 15000的氨基甲酸酯官能化的支化聚乙烯亚胺。
4. 如权利要求1所述的支化聚胺，其中所述支化聚胺在N/P 10至N/P 50下为非细胞 毒性的。
5. 如权利要求1所述的支化聚胺，其中L'包含糖部分。
6. 如权利要求5所述的支化聚胺，其中所述糖部分为甘露糖、半乳糖或葡萄糖部分。
7. 如权利要求1所述的支化聚胺，其中qAn'+q) X 100%等于约9%至约25%。
8. 如权利要求1所述的支化聚胺，其中q/(n'+q) X 100%等于约9%至约12%。
9. 如权利要求1所述的支化聚胺，其中所述氨基甲酸酯基团是不带电的。
10. 如权利要求1所述的支化聚胺，其中所述支化聚胺不含季胺基团。
11. 如权利要求1所述的支化聚胺，其中所述支化聚胺能够在基因转染过程中充当基 因载体。
12. 支化聚胺，其包含： 约45至约70个骨架叔胺基团，约90至约140个骨架仲胺基团，大于0的正数η'个骨 架末端伯胺基团，以及大于〇的正数q个通式（4)的骨架末端氨基甲酸酯基团：
其中 通式（4)的星号键与所述支化聚胺的骨架氮连接， R1为氢、甲基或乙基， R2为氢或包含1至27个碳的单价基团， (n' +q)为等于约45至约70的数，以及 q/ (n，+q) X 100 % 等于约 9 % 至约 47 %。
13. 如权利要求12所述的支化聚胺，其中R2为酯*-C( = 0) 0R3,其中R3包含1至26个 碳。
14. 方法，其包括： 用环状碳酸酯单体处理包含约45至约70个伯胺基团、多个仲胺基团和多个叔胺基团 的支化第一聚合物而不使所述环状碳酸酯单体聚合，从而形成包含以下的支化聚胺：i)约 45至约70个骨架叔胺基团，ii)约90至约140个骨架仲胺基团，iii)大于0的正数η'个 骨架末端伯胺基团，以及iv)大于〇的正数q个通式（2)的骨架末端氨基甲酸酯基团： 其中：
(n' +q)为等于约45至约70的数， 通式（2)的星号键与所述支化聚胺的骨架氮连接， L'为包含3至30个碳的二价基团，以及 q/ (n，+q) X 100 % 等于约 9 % 至约 47 %。
15. 如权利要求14所述的方法，其中所述环状碳酸酯单体包含一种或多种保护基，并 且所述方法进一步包括使所述支化聚胺脱保护。
16. 如权利要求14所述的方法，其中所述环状碳酸酯为6元环的环状碳酸酯。
17. 如权利要求14所述的方法，其中所述支化第一聚合物为基本由以下组成的枝化聚 乙烯亚胺： 约45至约70个具有下述结构的伯氮丙啶重复单元
约90至约140个具有下述结构的仲氮丙啶重复单元
以及 约45至约70个具有下述结构的叔氮丙啶重复单元
其中各星号键表示与所述骨架的另一重复单元的连接点。
18. 如权利要求14所述的方法，其中所述环状碳酸酯单体选自：
19.复合物，其包含： 基因；以及 支化聚胺，其包含约45至约70个骨架叔胺基团，约90至约140个骨架仲胺基团，大于 〇的正数η'个骨架末端伯胺基团，以及大于〇的正数q个通式（2)的骨架末端氨基甲酸酯
基团： 其中： (n' +q)为等于约45至约70的数， 通式（2)的星号键与所述支化聚胺的骨架氮连接， L'为包含3至30个碳的二价连接基团，以及 q/ (n，+q) X 100 % 等于约 9 % 至约 47 %。
20. 如权利要求19所述的复合物，其中所述基因为siRNA。
21. 处理细胞的方法，其包括使所述细胞与权利要求19所述的复合物接触。
22. 如权利要求21所述的方法，其中所述细胞为人类肿瘤细胞。
23. 如权利要求21所述的方法，其中所述细胞为肝癌细胞。
24. 如权利要求21所述的方法，其中所述细胞为宫颈癌细胞。
25. 如权利要求21所述的方法，其中所述细胞为卵巢癌细胞。
26. 如权利要求21所述的方法，其中所述细胞为人类间充质干细胞。
27. 支化聚胺，其具有通式（5)的结构：
其中j、k、m、n'和q表示大于0的摩尔数，j具有约185至约280的值，k具有约45至约 70的值，m具有约90至约140的值，（n' +q)具有约45至约70的值，以及qAn' +q) X 100% 具有约9 %至约47 %的值，并且各个Z'为选自以下的独立部分
【专利摘要】支化聚胺包含约45至约70个骨架叔胺基团，约90至约140个骨架仲胺基团，大于0的正数n'个骨架末端伯胺基团，以及大于0的正数q个通式(2)的骨架末端氨基甲酸酯基团：-CH2-CH2-N-(C＝O)-O-L'-OH(2)，其中(n'+q)为等于约45至约70的数，通式(2)的星号键与支化聚胺的骨架氮连接，L'为包含3至30个碳的二价基团，以及q/(n'+q)×100％等于约9％至约47％。
【IPC分类】A61K48-00, C08G73-02, A61K47-48
【公开号】CN104769011
【申请号】CN201380056847
【发明人】程薇, 丹尼尔·J·克迪, 阿曼达·C·恩格乐特, 詹姆士·L·海德瑞克, 张贝云, 杨川, 杨义燕
【申请人】囯际商业机器公司, 新加坡科技研究局
【公开日】2015年7月8日
【申请日】2013年9月4日
【公告号】EP2895526A1, US8703197, US20140080215, WO2014042920A1