一种靶向鼠T淋巴细胞CD3和人肿瘤抗原EpCAM的双特异性抗体制备方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及免疫学的技术领域。具体地说，涉及双特异性抗体的构建和制备方法， 以及设计建立鼠肿瘤模型，并进行双特异性抗体体外、体内药效和机理的研宄。为双抗体药 物开发过程中药物机理，特别是临床前动物体内药效的研宄提供有力的方法和模型。
【背景技术】
[0002] 双特异性抗体（bispecificantibody，BiAb)是含有两种特异性抗原结合位点的 人工抗体，能在靶细胞和功能分子（细胞）之间架起桥梁，产生导向性的效应功能。BiAb 在生物医学中，特别是在肿瘤的免疫治疗中具有广阔的应用前景。通过BiAb介导细胞毒作 用杀死肿瘤细胞是当前免疫治疗应用研宄的热点，其主要特点是BiAb能同时结合肿瘤相 关抗原和免疫效应细胞上的靶分子，直接触发免疫效应细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤。然 而，在双特异性抗体药物研发过程中，特别是体内药效研宄，很难建立一种由完整免疫系统 介导的人体肿瘤免疫杀伤的动物模型，因此建立完整的免疫杀伤模型对免疫治疗性双特异 性抗体药物研发显得尤为重要。以下是针对所研宄的免疫细胞抗原和肿瘤细胞抗原，以及 相关技术发展的一些【背景技术】介绍。
[0003] I.CD3
[0004] CD3分子由4个亚基组成：S、e、Y、e，其分子质量分别为18. 9kDa、23.IkDa、 20. 5kDa、18. 7kDa，其长度分别有171、207、182、164个氨基酸残基。它们一起组成6条肽 链，常与T细胞受体（Tcellrec印tor，TCR)紧密结合形成含有8条肽链的TCR-CD3复合体， 结构示意图见图1。此复合体具有T细胞活化信号转导，稳定TCR结构的功能。CD3胞质段含 免疫受体酪氨酸活化基序（immunoreceptortyrosine-basedactivationmotif,ITAM)， TCR识别并结合由MHC(majorhisto-compatibilitycomplex)分子提呈的抗原肽，导致 CD3的ITAM的保守序列的酪氨酸残基被T细胞内的酪氨酸蛋白激酶p561ck磷酸化，然后 可募集其他含有SH2(Scrhomology2)结构域的酪氨酸蛋白激酶（如ZAP-70)。ITAM的磷 酸化和与ZAP-70的结合是T细胞活化信号传导过程早期阶段的重要生化反应之一。因此， CD3分子的功能是转导TCR识别抗原所产生的活化信号。
[0005] 2.EpCAM
[0006] EpCAM(⑶326)是I型跨膜糖蛋白，作为上皮细胞的特异性细胞粘附分子。它还涉 及到其他一些过程，包括细胞迀移，增殖，分化等。EpCAM是最早应用单克隆抗体技术鉴定出 的肿瘤相关抗原之一，它以多聚体的形式广泛表达于上皮组织表面，介导钙非依赖性细胞 间同型黏附功能，据此可归入粘附分子家族。EpCAM还具备粘附分子家族的其他特性，参与 包括细胞与基质的相互作用、迀移、细胞分化、形态、细胞周期调节、信号传导、代谢等多种 过程。同时，EpCAM在多种上皮来源的肿瘤中呈过表达，提示其与肿瘤密切相关。病理情况 下，EpCAM不同程度的表达于腺癌中，包括结直肠癌、胃腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肺腺癌、前列 腺癌、胰腺癌以及肝细胞癌和视网膜母细胞瘤。多项研宄已证实EpCAM的表达与乳腺癌和 结肠癌细胞的增殖、周期分布、转移有关（见表1)。单特异性抗EpCAM单克隆抗体（MB)， 例如单抗17_lA(glaxowellcome，Centocor)，是第一个批准德国EpCAM导向治疗结直肠癌 的辅助治疗，然而，大量的临床用药数据显示，这种单特异性抗体与化疗相比没有明显的更 加有益的效果。目前，一些其他的EpCAM定向治疗，包括双特异性抗体，正在发展为癌症治 疗的方向，双特异性抗体MTllO和Catumaxomab都是针对肿瘤抗原EpCAM的治疗性双抗体 药物，其中Catumaxomab已于2009年由欧盟批准用于治疗恶性癌性腹水，MTllO已在临床 研宄中。显然，EpCAM已成为目前肿瘤治疗研宄的热点靶标之一。
[0007] 表IEpCAM广泛的肿瘤分布
[0008]
【主权项】
1. 一种双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体包括连接的A部分和B部分； 其中，A部分包括识别效应细胞表面触发分子的片段，所述细胞表面触发分子选自小鼠 的CD3、CD16和CD64 ;以及B部分包括识别祀细胞表面标志分子的片段，祀细胞表面标志分 子选自￡?0八11、0)19、0)20、0)30、￡6?1?和0)133; 优选地，A部分包括抗鼠CD3抗体片段，B部分包括抗肿瘤细胞表面抗原EpCAM的抗体 片段。
2. 权利要求1所述双特异性抗体，其特征在于，A部分包括效应细胞表面标志分子的 抗体片段和人IgGlFe;B部分包括靶细胞表面标志分子的抗体重链和轻链，所述靶细胞表 面标志分子的抗体重链和轻链之间通过二硫键连接，靶细胞表面标志分子的抗体重链与人 IgGlFc共价连接；并且A部分的效应细胞表面标志分子的抗体片段通过二硫键与B部分 连接，A部分的人IgGlFc通过盐桥和隆突-入-穴结构与B部分的人IgGlFc连接； 优选地，所述双特异性抗体的结构如图2所示。
3. 权利要求1所述双特异性抗体，其特征在于，A部分包括针对鼠源CD3的抗体 抗-mCD3, B部分包括针对人源EpCAM的抗体抗-EpCAM ; 优选地，A抗体为ScFv-Fc形式，包括抗-mCD3VH、VUFc结构域；并且B抗体为为IgG形式，包括抗-EpCAM重链与轻链； 更优选地，所述双特异性抗体为M706,其结构如图3所示； 再更优选地，所述抗-EpCAM重链的氨基酸序列为SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列，抗 -EpCAM的轻链的氨基酸序列为SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列，以及所述抗-mCD3ScFV-Fc 的氨基酸序列为SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列；并且抗-EpCAM重链在223位点上的半胱 氨酸与抗-EpCAM的轻链220位点上的半胱氨酸以二硫键的形式连接，所述抗-EpCAM重链 在229和232位点上的半胱氨酸与抗-mCD3ScF V-Fc的254和257位点上的半胱氨酸分别 以二硫键的形式连接；所述抗-EpCAM重链在395和412位点上与抗-mCD3ScFv-Fc的427 和396位点上形成盐桥连接，所述的抗-EpCAM重链在369位点上与抗-mCD3ScFv-Fc的435 位点上形成隆突-入-穴连接。
4. 制备权利要求1-3中任一项所述双特异性抗体的方法，其特征在于，所述方法包括 步骤： (1) 分别将B部分的重、轻链分别构建到第一表达载体上，将A部分构建到第二表达载 体上； (2) 将第一和第二表达载体一起共转染到细胞中，培养并取上清； (3) 将表达上清分离得到纯化后的双特异性抗体； 优选地，所述细胞是CHO-S细胞；或者 优选地，所述分离步骤包括：蛋白A亲和层析柱从表达上清中捕获所有带Fc结构域的 抗体，通过SP阳离子交换层析实现目标双特异性抗体与副产物的分离，再过Q柱，最后浓缩 置换缓冲液PBS。
5. 权利要求4所述方法，其特征在于，所述第一表达载体是pCHOl. 0。
6. 权利要求4或5所述方法，其特征在于，所述第二表达载体是p⑶NA3. 4。
7. 权利要求4所述方法，其特征在于，所述方法的步骤（1)包括： 通过正向引物M701-VL Fl与反向引物hlgK(PacI) R扩增抗-EpCAM轻链，再通过正向 引物Kozak(EcoRV)F与反向引物hIgK(PacI)RPCR扩增，将Kozak序列、前导序列及酶切 位点EcoRV与PacI引入轻链； 通过正向引物M701-VHFl与反向引物hlgGl(sbfl)R扩增抗-EpCAM重链，再通过正向 引物Kozak(AvrII)F与反向引物hlgGl(sbfl)RPCR扩增，将Kozak序列、前导序列及酶切 位点AvrII与BstZ17I引入重链； 先将扩增好的LC基因片段与用EcoRV与PacI酶切过的pCHOl. 0表达载体进行同源 重组，获得装入抗-EpCAM轻链的表达载体；然后用AvrII与BstZ17I酶切后再和HC进行同 源重组，获得抗-EpCAM的pCHOl.O表达载体，质粒命名为pCHOl.O-抗-EpCAM-HL-KKW; 通过正向引物^118614(：-卩与反向引物111861-01(7出8.他61)-1?口0)嫩3.4(7出8.NheI) -R两轮PCR扩增Fc结构域，通过正向Kozak(AfIII)F与反向引物AMC3-1-VL-R1 扩增抗_mCD3ScFv结构域，再通过正向引物hlgGl-FCF与反向引物p⑶NA3. 4(7His. NheI)-R/pCDNA3. 4(7His.Nhel)-ROverlapPCR扩增将Kozak序列、前导序列及酶切位 点AfIII与NheI引入ScFv或Fc，将扩增好的2个基因片段与酶切过的p⑶NA3. 4表 达载体进行同源重组，获得装入抗-mCD3ScFV-Fc的p⑶NA3. 4表达载体，质粒命名为 PCDNA3. 4-抗-mCD3ScFv-Fc-LDY。
8. 权利要求1-3中任一项所述双特异性抗体或者按照权利要求4-8中任一项制备的双 特异性抗体的方法制备的双特异性抗体在制备药物中的用途，所述药物用于治疗EpCAM特 异抗原表达所引起的肿瘤或相关疾病，或者用于杀死表达EpCAM细胞。
9. 权利要求1-3中任一项所述双特异性抗体或者按照权利要求4-8中任一项制备的双 特异性抗体的方法制备的双特异性抗体在制备药物中的用途，所述药物用于在鼠肿瘤细胞 系中筛选用于治疗表达EpCAM特异抗原的肿瘤细胞相关疾病的药物或者评价用于治疗表 达EpCAM特异抗原的肿瘤细胞相关疾病的药物的药效。
【专利摘要】本发明提供了一种双特异性抗体、其制备方法及用途。与此同时，还提供了表达人源EpCAM蛋白的鼠肿瘤细胞系及上述细胞系的用途。本申请的双特异性抗体能在靶细胞和功能分子(细胞)之间架起桥梁，激发具有导向性的免疫反应，在肿瘤的免疫治疗中具有广阔的应用前景。本发明的肿瘤细胞体内药效实验是在一个具备完整免疫系统的动物模型中开展的，利用免疫系统细胞对肿瘤进行杀伤，并能有效的反映双特异性抗体介导免疫细胞杀伤肿瘤细胞的药效，为靶向免疫细胞和肿瘤细胞的双特异性抗体药物开发提供一个很好药效评估方法。
【IPC分类】C12N15-85, C07K16-46, C07K16-30, A61K39-395, A61P35-00
【公开号】CN104788567
【申请号】CN201510031731
【发明人】张敬, 胡伶俐, 王瑞, 周祥, 范克索, 周鹏飞
【申请人】武汉友芝友生物制药有限公司
【公开日】2015年7月22日
【申请日】2015年1月21日