0035]为进一步得到更高纯度的146S抗原，取1mL收集的洗脱峰样品，进料到Sephacral S-400 凝胶过滤柱(GE Healthcare, 60cmX 2.6cm 1.D.)，流速为 3mL/min，流动相为含有0.15M氯化钠的50mM磷酸钠缓冲液，pH 7.2。分别检测洗脱峰组分的抗原浓度及总蛋白浓度，最后得到纯度大于98%以上的口蹄疫病毒抗原，所得抗原相对于细胞上清液的收率为54%。
[0036]实施例2
[0037]取10mL含口蹄疫病毒的细胞培养液上清，总蛋白浓度为4.5g/L，口蹄疫病毒抗原浓度为21 μ g/mL，用20mM Tris-HCl缓冲液，pH 9.0稀释10倍至电导率为lmS/cm，抗原浓度约2 μ g/mL。
[0038]将上清液与预先用氯化铵调至电导lmS/cm的Tris-HCl缓冲液(pH 9.0)平衡的Q Sepharose FF离子交换填料混合，100?200rpm搅拌吸附30min后，加至色谱柱中(GEHealthcare, 5cmX 1.6cm 1.D.)。经继续淋洗后，依次用氯化钱调至电导为10?40mS/cm的Tris-HCl缓冲液(pH 9.0)进行梯度洗脱，收集含口蹄疫病毒抗原回收率大于20%以上的紫外吸收峰的洗脱液。色谱填料采用IM氢氧化钠再生。
[0039]分别检测洗脱峰组分的抗原浓度及总蛋白浓度，最后得到146S抗原相对于细胞上清液的收率为84%，纯化倍数为6.5。
[0040]实施例3
[0041]取100mL含口蹄疫病毒的细胞培养液上清，总蛋白浓度为0.47g/L，口蹄疫病毒抗原浓度为2.8 μ g/mL。
[0042]使用截留分子量为300kDa的板式超滤膜(Sartorius)将细胞上清液一次浓缩到20mL左右，少量多次加入10mL 20mM pH 8.0磷酸钠缓冲液稀释，继续浓缩至1mL左右至电导率约5.0mS/cm ;超滤时膜流速为100cm/s，压力控制在0.3Mpa以下。口蹄疫病毒抗原终浓度为200 μ g/mL左右。
[0043]将上清液进料到预先用硫酸铵调至电导7mS/cm的磷酸钠缓冲液(pH 8.0)平衡的ANX Sepharose FF (high sub)离子交换色谱柱(GE Healthcare, 15cmX 1.6cm 1.D.)，进料后经继续淋洗后，分别用硫酸铵调至电导为10?40mS/cm磷酸钠缓冲液(pH 8.0)进行梯度洗脱，收集含口蹄疫病毒抗原回收率大于20%以上的紫外吸收峰的洗脱液。色谱填料采用IM氢氧化钠溶液再生。
[0044]分别检测洗脱峰组分的抗原浓度及总蛋白浓度，最后得到146S抗原相对于细胞上清液的收率为65%，纯化倍数为6.8。
[0045]实施例4
[0046]取10mL含口蹄疫病毒的细胞培养液上清，总蛋白浓度为0.47g/L，口蹄疫病毒抗原浓度为2.8 μ g/mL。
[0047]将上清液中加入硫酸钱至电导为10mS/cm，用盐酸调至pH 7.0，进料到预先用硫酸钱调至电导10mS/cm的磷酸钠缓冲液(pH 7.0)平衡的CM Sepharose FF离子交换色谱柱(GE Healthcare, 5cmX 1.6cm 1.D.)，进料后经继续淋洗后，收集穿透峰，依次用硫酸钱调至电导为40?lOOmS/cm磷酸钠缓冲液(pH 7.0)洗脱吸附在色谱填料上的杂质。色谱填料采用IM氢氧化钠溶液再生。
[0048]检测穿透组分的抗原浓度及总蛋白浓度，最后得到146S抗原相对于细胞上清液的收率为75%，纯化倍数为3.2。
[0049]实施例5
[0050]取10mL含口蹄疫病毒的细胞培养液上清，总蛋白浓度为0.47g/L，口蹄疫病毒抗原浓度为2.8 μ g/mL。
[0051]将上清液中加入氯化钠至电导为30mS/cm，用Tris-HCl缓冲液调至pH 9.0，进料到预先用氯化钠调至电导30mS/cm的Tris-HCl缓冲液(pH 9.0)平衡的SP Sepharose FF离子交换色谱柱(GE Healthcare, 5cmX 1.6cm 1.D.)，进料后经继续淋洗后，收集穿透峰，依次用硫酸铵调至电导为40?100mS/cm的Tris-HCl缓冲液(pH 9.0)洗脱吸附在色谱填料上的杂质。色谱填料采用IM氢氧化钠溶液再生。
[0052]检测穿透组分的抗原浓度及总蛋白浓度，最后得到146S抗原相对于细胞上清液的收率为78%，纯化倍数为3.4。
[0053]实施例6
[0054]取200mL含口蹄疫病毒的细胞培养液上清，总蛋白浓度为0.47g/L，口蹄疫病毒抗原浓度为2.8 μ g/mL。
[0055]使用截留分子量为300kDa的板式超滤膜(Sartorius)将细胞上清液一次浓缩到20mL左右，然后加入氯化钠至电导为30mS/cm，用磷酸缓冲液调至pH 8.0，进料到预先用氯化钠调至电导30mS/cm的磷酸钠缓冲液(pH 8.0)平衡的DEAE Sepharose FF离子交换色谱柱(GE Healthcare, 5cmX 1.6cm 1.D.)，进料后经继续淋洗后，收集穿透峰，依次用硫酸铵调至电导为40?lOOmS/cm磷酸钠缓冲液(pH 9.0)洗脱吸附在色谱填料上的杂质。色谱填料采用IM氢氧化钠溶液再生。
[0056]检测穿透组分的抗原浓度及总蛋白浓度，最后得到146S抗原相对于细胞上清液的收率为68%，纯化倍数为5.4。
【主权项】
1.一种根据离子交换原理从细胞培养液中分离纯化口蹄疫灭活病毒抗原的方法，该方法以离子交换色谱为工具，通过离子交换色谱填料上的带电基团与口蹄疫灭活病毒抗原溶液中不同带电组分的相互作用，将口蹄疫灭活病毒抗原和杂蛋白质、核酸分离，从而达到提纯口蹄疫灭活病毒抗原的目的。
2.根据权利要求1，离子交换色谱的模式可以是将离子交换色谱填料加入到含有口蹄疫灭活病毒抗原的细胞培养液中，然后再将填料装入色谱柱中进行色谱操作，或者是将含有口蹄疫灭活病毒抗原的细胞培养液直接加入到装有离子交换色谱填料的色谱柱中进行色谱操作。
3.根据权利要求1和2，溶液pH和电导率决定离子交换色谱吸附口蹄疫灭活病毒抗原或吸附杂质。
4.根据权利要求1，当用离子交换色谱吸附口蹄疫灭活病毒抗原的时候，细胞培养液的pH须调整为7.0?9.0、电导为I?7mS/cm。
5.根据权利要求1，当用离子交换色谱吸附杂蛋白质和核酸而不吸附口蹄疫灭活病毒抗原时，细胞培养液的PH须调整为7.0?9.0、电导为10?30mS/cm。
6.根据权利要求1和5，调节pH和电导所用的盐为磷酸盐，三羟甲基氨基甲烷，盐酸，硫酸铵、氯化钠、氯化铵。
7.根据权利要求1，离子交换色谱填料表面的离子交换基团为二乙基氨基乙基(DEAE)、季铵基(Q)、二乙基氨基丙基(ANX)、羧甲基(CM)或磺酸基(SP)。
8.根据权利要求1，细胞培养液中的口蹄疫灭活病毒抗原146S的浓度为2-100μ g/ml。
9.根据权利要求4，从离子交换色谱柱上洗脱口蹄疫灭活病毒抗原所用的洗脱液为电导为10?40mS/cm的缓冲液，pH 7.0?9.0。
10.根据权利要求5，从离子交换色谱柱上洗脱杂蛋白质和核酸所用的洗脱液为电导为40?100mS/cm的缓冲液，pH 7.0?9.0。
【专利摘要】本发明涉及一种从细胞培养液中分离纯化口蹄疫灭活病毒抗原的方法。该方法利用离子交换色谱填料上的带电基团与口蹄疫灭活病毒抗原溶液中不同带电组分的相互作用，将口蹄疫灭活病毒抗原和杂蛋白质、核酸分离，从而达到提纯口蹄疫灭活病毒抗原的目的。该方法操作步骤少，工艺稳定，纯化速度快，口蹄疫灭活病毒抗原收率较高，且易于放大与工业化规模生产，具有较大的实际应用价值。
【IPC分类】C12R1-93, C12N7-02
【公开号】CN104818254
【申请号】CN201510228052
【发明人】张松平, 苏志国, 杨延丽, 马光辉, 李 浩, 张焱
【申请人】中国科学院过程工程研究所
【公开日】2015年8月5日
【申请日】2015年5月6日