一种肝脏干细胞的培养基及培养方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及干细胞培养领域，尤其涉及一种肝脏干细胞的培养基及培养方法。
【背景技术】
[0002] 肝脏是人体的重要器官，发挥很多重要的功能，如：葡萄糖的体内平衡、异性生物 质的脱毒或大分子合成。我国是"肝炎大国"，是各型发病率较高的国家，多种病毒性肝炎及 相关肝病严重危害着我国人民的身体健康。肝脏功能受损会对健康产生显著影响，急或慢 性肝病已成为全球第九或第五位的致死原因。目前为止，对晚期肝脏疾病的根治方法只有 肝脏移植术。肝脏细胞移植是一种新兴的方法，现有技术中已有利用流产胎儿的肝脏组织 培养肝脏干细胞用于治疗肝硬化或糖尿病的先例，病取得了良好的疗效。
[0003] 当肝脏严重受损或成熟肝细胞增殖受阻的情况下，一些肝脏细胞可以异常激活、 增殖，大量出现在肝小叶外周区域，组织学上表现为肝小叶周围体积较小、增殖活跃的细胞 群体。这些细胞核质较大，胞核圆形或卵圆形，被称为肝卵圆形细胞（H0C)，1958年，Wilson 等推测肝卵圆细胞可能是肝的干细胞。肝干细胞属于前体细胞，在肝细胞移植、体外人工 肝、基因治疗方面有着巨大的潜力，对于了解肝细胞的发育及肝癌、肝硬化等疾病的发生机 制都有重要帮助。
[0004] 但是，现有的肝脏干细胞的培养方法，处理肝组织的时间长，处理步骤多易对干细 胞造成污染和损伤。并且，由于现有技术培养基或培养条件选择不当，使肝干细胞在体外培 养时，增殖速度慢，且会伴随自发分化；其在体外培养一段时间细胞会全部分化形成终端分 化细胞。
【发明内容】
[0005] 有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种肝脏干细胞的培养基及培养方 法。
[0006] 本发明提供了一种肝干细胞培养基，包括基础培养基、HGF、SCF和LIF。
[0007]HGF(肝细胞生长因子）能刺激多种上皮和内皮细胞进行有丝分裂、运动以及促进 肾小管形态发生，在组织器官损伤修复、形态发生和肿瘤转移过程中发挥重要作用，在肾脏 的发育、急性损伤、再生中具有较强的作用。
[0008]SCF(干细胞生长因子）可以快速激活休眠的干细胞并促使其生长，同时可以调节 机体内微环境，为干细胞提供有利的生长条件。
[0009]LIF(白血病抑制因子）能够调节细胞的增殖、分化和表型。
[0010] 本发明提供的培养基在基础培养基中添加HGF、SCF和LIF，配方稳定不易分解。且 配置简单，成本较低。经实验证实本发明提供的培养基能够加速细胞增殖，且能够维持细胞 良好干性状态。
[0011] 作为优选，基础培养基为Lonza完全培养基。
[0012] Lonza完全培养基包括：无血清培养基（LonzaUltra⑶LTURETM)、血清替代物 (PALLUltroser G)、谷氨酰胺和NEAA。
[0013] 其中，血清代替物的质量分数为10%。
[0014] 谷氨酰胺的质量分数为1%。
[0015]NEAA的质量分数为1 %。
[0016] 在本发明的实施例中，HGF、SCF和LIF的质量比为1:1:1。
[0017] 在本发明的实施例中，HGF的浓度为10ng/mL;SCF的浓度为10ng/mL;LIF的浓度 为 10ng/mL〇
[0018]与现有的培养基相比，本发明提供的培养基能够将细胞增殖速度提高1.5倍~ 2. 8 倍。
[0019] 本发明还提供了一种肝干细胞培养方法，包括：将胎肝以I型胶原酶和II型胶原 酶消化后，经免疫磁珠分离，接种于权利要求1~4任一项所述的肝干细胞培养基，培养至 80%以上的细胞融合后传代。
[0020] 本发明提供的方法从原代分离的细胞，经过磁珠分选后才进行接种，避免在培养 过程中杂细胞与肝干细胞形成竞争，从而避免造成细胞的污染和培养周期的延长。
[0021] 在本发明的实施例中，免疫磁珠分离的筛选抗体为C_kit+、AFP+和CK19 +。
[0022] 目前，由于肝干细胞表面因子较少，很难通过因子对其进行筛选和定位，本发明采 用C_kit+、AFP+和CK19 +作为筛选抗体能够更为精确的分选出肝干细胞，所获得的的肝干细 胞纯度较高。并且，该方法分离得到的细胞损伤较小，活性较高。
[0023] 具体的，磁珠分选的方法为：将消化后的胎肝细胞清洗后，重悬，以C_kit+、AFP+和 CK19+为筛选抗体，4°C~8°C孵育15分钟后，通过分离柱筛选获得肝干细胞。
[0024] 缓冲液稍用力冲洗，在本发明的实施例中，接种的细胞密度为1 X 105个/mL。
[0025] 在本发明的实施例中，培养的温度为37°C、5%C02。
[0026] 在一些实施例中，消化具体为：胎肝用PBS冲洗，破碎后用I型胶原酶和II型胶原 酶，4°C消化过夜；消化后组织用200目筛网过滤，获得的细胞悬液200g离心5min，细胞沉 淀用PBS洗2次。
[0027] 在本发明的实施例中，I型胶原酶的质量分数为0.02% ;11型胶原酶的质量分数 为 0.02%。
[0028] 在本发明的实施例中，胎肝为大鼠胎肝。
[0029] 在一些实施例中，胎肝的获得方法为：脱白处死怀孕大鼠，经过体积分数为75% 乙醇对大鼠体表消毒，无菌条件取出胎肝。
[0030] 本发明提供了一种肝干细胞培养基，包括基础培养基、HGF、SCF和LIF。本发明提 供的干干细胞的培养方法采用免疫磁珠于原代即对肝干细胞进行分离，然后培养于本发明 提供的培养基。本发明提供的方法能够避免肝干细胞在培养过程中的污染和损伤，且与原 代即对肝干细胞进行分离，从而缩短了培养时间，且该方法较柔和，保持了干细胞良好的活 性。本发明采用适宜的培养基，从而提高了细胞的增殖速度，保证了细胞具有良好的干性。 实验表明，在原代细胞的获得过程中，细胞损伤较小，经检测，活性维持在85 %左右，且本发 明提供的方法培养肝干细胞能够将增值速度提高1. 5~2. 8倍，经流式细胞检测，肝干细胞 能够维持良好的干性。
【附图说明】
[0031] 图1-a示对数期肝干细胞形态；
[0032] 图l_b示80%融合的肝干细胞形态；
[0033] 图2示不同培养基培养的肝干细胞的增殖曲线；其中，线1示培养基3培养肝干细 胞的增殖曲线；线2示培养基4培养肝干细胞的增殖曲线；线3示培养基1培养肝干细胞的 增殖曲线；线4示培养基2培养肝干细胞的增殖曲线；
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