新型聚合酶底物:荧光可产生多聚磷酸末端标记核苷酸及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一类5'-末端磷酸荧光标记的核苷酸，及其在核酸碱基序列测定方 法中的应用。
【背景技术】
[0002] 在DNA聚合酶参与的DNA复制放大、核苷酸序列边合成边测定等应用中，都涉及 到核苷酸分子的标记技术，近年来，荧光标记的核苷酸被充分运用到DNA高通量测序技术 中，其中，标记技术之一是将不同的荧光基团通过可切断长链连接到核苷酸碱基的特定位 置上，在DNA完成识别并记录荧光信号之后通过额外的化学手段去除该标记基团，进而为 下一轮的核苷酸导入做准备。该技术现已被illumina公司为代表的商业机构发展成熟并 占据主要市场应用地位（US7057026;7566537)。但这种在核苷酸碱基上进行荧光标记的 方式仍然存在一定的局限一每次化学切除标记分子所存留的'分子疤痕'都造成新合成 的DNA分子在一定程度后不可避免的形态改变，阻止聚合酶分子的有效结合，从而影响测 序读取长度。因而，发展新的核苷酸标记手段，进而发展新的DNA高通量测序技术都是目 前市场需求和科学研宄追逐的热点。相对于在核苷酸碱基上进行的标记的技术，对核苷酸 的5'-末端磷酸进行标记的技术也很早就应用于生物化学和有关的生物技术研宄中。通 过在末端磷酸位置上引入不同功能的标记物，可以帮助人们了解各种核苷酸参与的生理过 程。而在核苷酸末端磷酸上引入荧光标记基团，核酸聚合酶在识别并正确引入核苷酸后将 自动切除剩余部分的磷酸基团以及其末端带有的荧光标记物，从而保证新合成的DNA的自 然结构，有利于聚合酶在长区间内连续引入碱基的快速性和准确性。这些潜在特点驱使着 人们将5'-末端磷酸标记核苷酸应用到诸如高通量DNA测序、单核苷酸多态性筛查等方面 的实际应用中。然而，保证这些应用的关键之处在于核苷酸的5'-磷酸末端引入荧光标 记基团后，该被标记核苷酸能被DNA聚合酶顺利的识别出来。2005年Sood等人的研宄已 经证明（Sood，A.等J.Am.Chem.Soc. 2005,127, 2394)，将荧光标记分子直接连接在三磷酸 脱氧核糖核苷酸（dNTP)的末端磷酸上并不是理想的标记方式，因为一方面标记上的荧光 基团占用了磷酸链上的一个负电荷，减少了磷酸与DNA聚合酶催化中心金属离子的结合能 力；另一方面，荧光基团所造成的位阻效应使得核苷酸不容易接近并进入DNA聚合酶的活 性催化中心，从而减缓了DNA聚合酶对被标记核苷酸分子的正确识别和反应速率。因而，研 宄合成具有更长磷酸链的末端磷酸荧光标记核苷酸技术是人们研宄的目标。
[0003] 在研宄长链末端磷酸荧光标记的方法中，有两个不同的方向，其中一个方向是作 为标记的荧光分子在DNA聚合酶作用前后的各种阶段荧光性质保持不变，因而可以使用长 的化学惰性链接分子将荧光标记物'锚定'在核苷酸的末端磷酸上，这一技术以Stephen W.Turner等人发展的末端磷酸标记技术为代表（Nucleosides，Nucleotides&Nucleic Acids，2008, 27,1072-1083);尽管这种技术可以实现标记分子远离聚合酶催化位点，但由 于不能体现聚合酶将核苷酸结合到新合成DNA上这一化学过程前后的荧光变化，因而只能 应用于特定的场合。第二种技术，也就是本发明所讨论的标记技术，所标记的荧光分子以共 价键直接与磷酸分子结合，并且在'结合'和'解离'两个状态下荧光分子的性质呈现'关 闭'和'开启'两个不同状态，或者说在荧光标记分子处于与末端磷酸的结合状态时其荧光 性质处于淬灭状态，不能被特定波长的激发光所激发；而一旦被聚合酶和磷酸酶所释放后 立即回到可激发状态，从而给出荧光信号。这一特定的性质为我们发展基于荧光信号产生 的诸如DNA碱基序列测定技术等应用提供了前提。然后在聚合酶反应动力学方面，核苷酸 5' _磷酸末端荧光基团的引入在一定程度上增加了核苷酸进入聚合酶催化中心的位阻效 应，从而影响了聚合酶的反应动力学性质，使得反应与自然状态核苷酸（未经修饰的核苷 酸）相比速度变慢。另外被标记核苷酸的背景荧光信号，即荧光基团被释放之前的荧光淬 灭程度，以及荧光基团释放之后的荧光强度（消光系数与量子产率的乘积），荧光性质（吸 收/发射波长），都受所选择的荧光基团直接影响。
[0004] 针对这些存在的问题，本发明采用新颖的荧光染料来解决被标记的核苷酸的荧 光背景以及释放后荧光基团的荧光强度和荧光性质问题。另一方面，本发明在不同长 度多聚磷酸链的合成方面采用了新的方法，以解决标记分子与聚合酶催化活性中心之 间的位阻问题。在磷酸链的合成方面，ShivKumar等作了有益的探索（Nucleosides， Nucleotides&NucleicAcids，2005, 24,401 ;)，但仍然存在合成方法不直接、难以合成长磷 酸链（例如多于五个磷酸）。因而，本发明公开了新的合成具有不同长度多聚磷酸链的末端 标记核苷酸分子的方法，并通过采用吸光系数和量子产率高，淬灭效果好，激发波长适合核 苷酸序列测定应用的荧光分子来实现这一类具有荧光可产生性质的末端磷酸标记核苷酸 的实际应用。
【发明内容】
[0005] 本发明涉及一类5'-末端磷酸荧光标记的核苷酸，提供了分子结构及合成方法。 该类分子可以更好地被DNA聚合酶所识别，并且在被聚合酶识别并正确结合之后在碱性 磷酸酶协助下实现荧光信号由关闭向开启状态的快速转变，从而作为聚合酶底物可以被应 用于核酸序列测定等领域中。本案中具体的荧光分子的合成方法在申请人申请的专利CN 201510155218. 9中有更详细的说明。
[0006] 本发明提供一种末端磷酸荧光标记的核苷酸结构，其特征在于：具有如下通式 (1)所示结构，
[0007]
【主权项】
1. 一种末端磷酸荧光标记的核苷酸结构，其特征在于：具有如下通式（1)所示结构，
其中Ra，Rb可以独立的选自-H，-OH;n为大于等于1，并且小于等于5的整数； 其中，通式（1)中的荧光基团具备下面通式（2)所述结构，
其中，通式（2)中Ri，R5可独立的选自-H、氟、氯、溴、芳基、取代芳基、C1-C6烷基、取代 的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、取代的C1-C6烷氧基； ^…札^可以独立的选自-瓜氟~氯:溴~芳基~取代芳基~杂芳基厂⑶办-⑶木、03H、-S03R、-CH2C02H、-CH2C02R、-CH2S03H、-CH2S03R、-CH2NH2、-CH2NHR、-N02、C1-C6 烷基、取代的 C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、取代的C1-C6烷氧基、C1-C6烷氧基芳基、取代的C1-C6烷氧基 芳基、苯基、取代苯基、联苯基、取代联苯基、苄基、取代苄基、苯甲酰基、取代苯甲酰基，其中 R选自C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、取代的C1-C6烷氧基、C1-C6烷氧基 芳基、取代的C1-C6烷氧基芳基、苯基、取代苯基、联