一种百尾参多糖的分离提取方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于天然药物技术领域，具体来说涉及一种百尾参多糖的分离提取方法。
[0002]
【背景技术】
[0003] 百尾参为百合科（Zi/iaceae)万寿竹属植物万寿竹應 」iferr.)的根及根莖，另IJ名又叫白味参、百尾舆、白龙须。百尾参为多年 生草本植物，系苗族习用药材，其味甘、淡，性平，具有润肺止咳、健脾消积的功效，可用于 虚损咳喘、痰中带血、肠风下血、食积胀满等症状。
[0004] 以百尾参为主药的上市复方制剂有贵州百灵企业集团制药股份有限公司生产的 咳速停糖浆及胶囊。在成分研宄方面，陈磊等人采用化学分离方法，运用现代波谱技术，从 百尾参乙醇提取物中得到了蒲公英赛醇（DCP-1)、木犀草素（DCP-2)、谷留醇（DCP-4)、胡萝 卜苷（DCP-5)等20个化合物，但对其主要有效成分的研宄较少。
[0005] 目前，尚未见对百尾参多糖进行相关研宄的报道。
[0006]
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种具有抗氧化活性、止咳祛痰作用的百尾参多糖的分离 提取方法。
[0008] 本发明的一种百尾参多糖的分离提取方法，包括以下步骤： (1) 脱脂：将百尾参粉末与石油醚按料液比1:50在索氏提取器中，于50°C下回流脱脂 3小时，得去脂百尾参粉末； (2) 提取：向去脂后的百尾参粉末中添加蒸馏水，料液比为1:20-80,于70-100°C下，提 取1-4次，每次1-4小时，提取结束合并水提液； (3) 分离：水提液用布氏漏斗抽滤，滤液与95%乙醇按1:3. 5-4的比例醇沉，静置6-8h ; 3000-4000r/min离心15-20min，去掉上清液，沉淀用蒸馏水定容到500ml ; (4) AB-8树脂脱色纯化、浓缩至原体积的1/3,得粗多糖液； (5) 脱蛋白：粗多糖液按质量比3:1的比例加入氯仿和正丁醇的混合液，混合液中氯仿 与正丁醇体积比为5:1，振摇后取上层清液，加入3-5倍体积的质量浓度为95%的乙醇，于 4°C下静置24小时，然后通过3000-4000r/min离心15-20min得脱蛋白百尾参多糖； (6) 洗涤，冷冻干燥即得。
[0009] 上述的一种百尾参多糖的分离提取方法，其中：百尾参粉末是将新鲜百尾参洗净， 干燥后粉碎所得。
[0010] 上述的一种百尾参多糖的分离提取方法，其中：步骤（3)中所述百尾参粉末和蒸 馏水的优选料液比为1:40-60。
[0011] 上述的一种百尾参多糖的分离提取方法，其中：步骤（3)中所述提取温度优选为 8〇°c -loo。。。
[0012] 上述的一种百尾参多糖的分离提取方法，其中：步骤（3)中所述提取时间优选为 2-4小时。
[0013] 上述的一种百尾参多糖的分离提取方法，其中：步骤（3)中所述提取次数优选为 2-4 次。
[0014] 上述的一种百尾参多糖的分离提取方法，其中：步骤（7)中依次采用乙醇、丙酮洗 涤。
[0015] 本发明与现有技术相比，具有明显有益效果，从以上技术方案可知：本发明的分离 提取方法，可获得纯度高、品质好的百尾参多糖，通过对小鼠酚红祛痰作用及对小鼠氨水引 咳试验研宄，证明该百尾参多糖具有较强止咳祛痰作用，同时其还具有明显的抗氧化活性， 该抗氧化活性包括? 0H清除率、DPPH ?清除率、Fe2+螯合能力、抗氧化能力及还原能力。且 方法简单、易操作，因而极具市场推广价值。
[0016]
【附图说明】
[0017] 图1是百尾参多糖对? 0H清除率； 图2是百尾参多糖对DPPH ?清除率； 图3是百尾参多糖对Fe2+螯合能力； 图4是百尾参多糖的抗氧化能力； 图5是百尾参多糖的还原能力。
[0018]
【具体实施方式】
[0019] 下面通过药效试验例来进一步说明本发明的有益效果。
[0020] 以实施例5得到的产品进行百尾参多糖药效实验研宄： 1、百尾参多糖的抗氧化活性 1. 1.清除? 0H活性 在10ml的试管中加入3mmol/L的？6304溶液lml，3mmol/L水杨酸-乙醇溶液lml，0. 05% 的H202溶液lml，立即混勾，百尾参糖溶液的浓度为4mg/ml，在7根试管中分别加入20ul， 40ul，80ul，160ul，320ul，640ul，1000ul的百尾参糖溶液，用蒸馏水补齐以等体积 的蒸馏水作为空白对照。37°C反应30min，在510nm下测量各浓度的吸光度。
[0021] 清除率计算公式为：清除率（％) = (AO-AX) /AO X 100% 其中&为空白对照液的吸光值；A x为加入不同浓度糖溶液的吸光值。
[0022] 结果见图1。
[0023] 1. 2?清除 DPPH ?活性 以95%乙醇为溶剂，配制浓度为2X 10-4mol/L的DPPH溶液。精确移取加入2mlDPPH 溶液，百尾参糖溶液的浓度为4mg/ml，在7根试管中分别加入40ul，80ul，160ul，320ul， 640ul，1280ul，2000ul的百尾参糖溶液，用蒸馏水补齐2ml使总体积为4ml，摇匀。室温放 置30min后记录517nm吸光值为A样品，向2mlDPPH液中加入2ml的相应样品溶剂，记录吸 光值为A空白，即空白对照。
[0024] 根据公式计算样品DPPH清除率，计算公式为： DPPH清除率（％) = (A空白一 A样品）/A空白X 100%。
[0025] 结果见图2。
[0026] 1. 3. Fe2+螯合能力的测定 百尾参糖溶液的浓度为4mg/ml，在7根试管中分别加入20ul，40ul，80ul，160ul， 320ul，640ul，lOOOul的百尾参糖溶液，用蒸馏水补齐lml，再加入3. 7ml蒸馏水， 0? lml2mmol的卩6〇12溶液，混合均勾，最后加入0? 2ml5mmol的ferrozine启动反应，空白 管用蒸馏水代替样品液，标准管用蒸馏水代替FeCl2溶液，反应体系在室温放置30min，在 562nm处测定吸光值，同时以EDTA做对比。
[0027] 用公式计算对金属螯合能力（％)，计算公式为： 金属螯合能力（％) =[A空白-(A样品-A标准）]/A空白X 100%。
[0028] 结果见图3。
[0029] 1.4.总抗氧化能力的测定 百尾参糖溶液的浓度为4mg/ml，在7根试管中分别加入20ul，40ul，80ul，160ul， 320ul，640ul，lOOOul的百尾参糖溶液，用蒸馏水补齐lml，再加入4ml试剂液（0. 6mol/L硫 酸，28mmol/L磷酸钠和4mmol/L钼酸钠)，混勾后置于95°C水浴中恒温90min，在695nm处 测其吸光度A。空白液用0.4ml水代替样品液。A越大，则样品的还原能力越强。以VC为 对照。
[0030] 结果见图4。
[0031] 1.5?总还原能力的测定 百尾参糖溶液的浓度为4mg/ml，在7根试管中分别加入20ul，40ul，80ul，160ul， 320ul，640ul，lOOOul的百尾参糖溶液，用蒸馏水补齐lml，再加入2.5ml磷酸缓冲液 (0.2mol/，PH=6.6)和2.5ml 1%铁氰化钾。此混合物在50°C放置20min后，加入2.5ml 10% 三氧乙酸，然后3000r/min离心10min吸取2. 5ml上清液，加入2. 5ml蒸馏水和0. 5ml 0. 1% 三氧化铁，混匀后在700nm波长下测定吸光度A。用水作空白对照，所以平行测定3次。吸 光值越高说明样品的还原能力越强。以VC为对照。
[0032] 结果见图5。
[0033]2、百尾参多糖的止咳祛痰作用 2.1.百尾参提取物对小鼠酚红祛痰作用的影响 取健康清洁级昆明种雄性小鼠（20±2g)gll4只，随机分为14组：阴性对照组、百尾参 多糖大剂量组（250mg/kg)、中剂量组（125mg/kg)、小剂量组（63mg/kg)、急支糖浆组（20ml/ kg)。空白对照组灌胃生理盐水，其余各组分别给予相应剂量的药液。灌胃给药连续5天， 每天1次。最后一次给药前禁食不禁水12h，给药后30min腹腔注射0. 5%苯酚红纯化水溶 液0.5ml，30min后脱颈椎处死小鼠，暴露气管，气管插管与注射器链接，用2%碳酸氢钠溶 液0. 5ml，缓慢注入气管内，然后轻轻吸出，如此反复三次。合并3次冲洗液放置一定时间使 杂质沉淀，得到透明红色上清液，用紫外分光光度计于558nm处测定A值，根据苯酚红标准 曲线回归方程分别算出其粉红浓度，于阴性对照组比较。结果如表2. 1 表2. 1参多糖对小鼠酚红排除试验的影响（X 土 S，n=8)
【主权项】
1. 一种百尾参多糖的分离提取方法，包括以下步骤： (1) 脱脂：将百尾参粉末与石油醚按料液比1:50在索氏提取器中，于50°C下回流脱脂 3小时，得去脂百尾参粉末； (2) 提取：向去脂后的百尾参粉末中添加蒸馏水，料液比为1:20-80,于70-100°C下，提 取1-4次，每次1-4小时，提取结束合并水提液； (3) 分离：水提液用布氏漏斗抽滤，滤液与95%乙醇按1:3. 5-4的比例醇沉，静置6-8h; 3000-4000r/min离心15-20min，去掉上清液，沉淀用蒸馏水定容到500ml; (4) AB-8树脂脱色纯化、浓缩至原体积的1/3,得粗多糖液； (5) 脱蛋白：粗多糖液按质量比3:1的比例加入氯仿和正丁醇的混合液，混合液中氯仿 与正丁醇体积比为5:1，振摇后取上层清液，加入3-5倍体积的质量浓度为95%的乙醇，于 4°C下静置24小时，然后通过3000-4000r/min离心15-20min得脱蛋白百尾参多糖； (6) 洗涤，冷冻干燥即得。
2. 如权利要求1所述的一种百尾参多糖的分离提取方法，其中：步骤（3)中所述百尾参 粉末和蒸馏水的料液比为1:40-60。
3. 如权利要求1或2所述的一种百尾参多糖的分离提取方法：其中，步骤（3)中所述提 取温度为80°C-KKTC。
4. 如权利要求3所述的一种百尾参多糖的分离提取方法，其中：步骤（3)中所述提取时 间为2-4小时。
5. 如权利要求4所述的一种百尾参多糖的分离提取方法，其中：步骤（3)中所述提取次 数为2-4次。
6. 如权利要求5所述的一种百尾参多糖的分离提取方法，其中，：步骤（7)中依次采用 乙醇、丙酮洗涤。
7. 如权利要求5所述的一种百尾参多糖的分离提取方法，其中：百尾参粉末是将新鲜 百尾参洗净，干燥后粉碎得到。
【专利摘要】本发明公开了一种百尾参多糖的分离提取方法，包括以下步骤：将新鲜百尾参洗净，干燥后粉碎；与石油醚回流脱脂；添加蒸馏水提取，提取结束合并水提液；水提液用布氏漏斗抽滤，滤液醇沉后静置、离心、去掉上清液，沉淀用蒸馏水定容；脱色纯化、浓缩，得粗多糖液；粗多糖液按质量比3:1的比例加入氯仿和正丁醇的混合液，振摇后取上层清液，加入乙醇、静置、离心，得脱蛋白百尾参多糖；洗涤，冷冻干燥即得。本发明的分离提取方法，可获得纯度高、品质好的百尾参多糖，方法简单、易操作，极具市场推广价值。
【IPC分类】C08B37-00
【公开号】CN104844720
【申请号】CN201510143327
【发明人】曹剑锋, 任朝辉, 刘丹, 夏丽莎, 庞宇云, 兰世超
【申请人】贵州师范学院
【公开日】2015年8月19日
【申请日】2015年6月19日