多聚磷酸末端荧光标记核苷酸及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一类5'-末端磷酸荧光标记的核苷酸，及其在核酸序列测定过程中 的应用。
【背景技术】
[0002] 在DNA聚合酶参与的DNA复制放大、核苷酸序列边合成边测定等应用中，都涉及 到核苷酸分子的标记技术，近年来，荧光标记的核苷酸被充分运用到DNA高通量测序技术 中，其中，标记技术之一是将不同的荧光基团通过可切断长链连接到核苷酸碱基的特定位 置上，在DNA完成识别并记录荧光信号之后通过额外的化学手段去除该标记基团，进而为 下一轮的核苷酸导入做准备。该技术现已被illumina公司为代表的商业机构发展成熟并 占据主要市场应用地位（US 7057026 ;7566537)。但这种在核苷酸碱基上进行荧光标记的 方式仍然存在一定的局限每次化学切除标记分子所存留的'分子疤痕'都造成新合 成的DNA分子在一定程度后不可避免的形态改变，阻止聚合酶分子的有效结合，从而影响 测序应用的读取长度。因而，发展新的核苷酸标记手段，进而发展新的DNA测序技术都是 目前市场需求和科学研宄追逐的热点。相对于在核苷酸碱基上进行标记的技术，在核苷酸 的5'-磷酸末端进行标记的技术也很早就应用于生物化学和有关的生物技术研宄中。通 过在末端磷酸位置上引入不同功能的标记物，可以帮助人们了解各种核苷酸参与的生理过 程。这种在磷酸末端进行标记的特点是，聚合酶在正确识别并反应结合受标记的核苷酸后， 将切断并释放剩余部分的带有标记物的多磷酸基团，新合成的DNA上没有残留基团或分子 片段，从而保证里新合成DNA的自然结构。这有利于聚合酶在长区间内连续引入碱基的快 速性和准确性。这些潜在特点驱使着人们将5'-末端磷酸标记核苷酸应用到诸如高通量 DNA测序、单核苷酸多态性筛查等方面的实际应用中。然而，保证这些应用的关键之处还 在于在核苷酸的5磷酸末端引入标记基团特别是荧光标记基团后，该核苷酸能被DNA 聚合酶顺利的识别出来。2005年Sood等人的研宄中已经证明（Sood，A.等J. Am. Chem. Soc. 2005,127, 2394)，将荧光标记分子直接连接在三磷酸脱氧核糖核苷酸（dNTP)的末端 磷酸上并不是理想的标记方式，因为一方面标记上的荧光基团占用了磷酸链上的一个负电 荷，减少了磷酸与DNA聚合酶催化中心金属离子的结合能力；另一方面，荧光基团所造成的 位阻效应使得核苷酸不容易接近并进入DNA聚合酶的活性催化中心，从而减缓了 DNA聚合 酶对带有标记的正确核苷酸分子的识别速率。因而，研宄合成具有长链末端磷酸荧光标记 的核苷酸是人们要实现的目标。
[0003] 在研宄长链末端磷酸荧光标记的方法中，有两个不同的方向，其中一个方向是作 为标记的荧光分子在DNA聚合酶作用前后的各种阶段荧光性质保持不变，因而可以使用长 的化学惰性链接分子将荧光标记物'锚定'在核苷酸的末端磷酸上，这一技术以Stephen W. Turner等人发展的末端磷酸标记技术为代表（Nucleosides，Nucleotides&Nucleic Acids，2008, 27,1072-1083);尽管这种技术可以实现标记分子远离聚合酶催化位点，但由 于不能体现聚合酶将核苷酸结合到新合成DNA上这一过程前后的荧光变化，因而只能应用 于特定的场合。第二种技术，也就是本发明所讨论的标记技术，是所标记的荧光分子在与其 共价结合的磷酸分子在'结合'和'解离I两个状态下存在荧光性质的'关闭'和'开 启'状态的不同，或者说在荧光标记分子处于与末端磷酸的结合状态时其荧光性质处于淬 灭状态，不能被特定波长的激发光所激发；而一旦被聚合酶和磷酸酶所释放后立即回到可 激发状态，从而给出荧光信号。这一特定的性质为我们发展基于荧光信号产生的诸如DNA 高通量测序技术等应用提供了前提。
[0004] 为解决标记分子与聚合酶催化活性中心之间的位阻问题，人们在合成更长的多 聚磷酸链方面作了很多工作（Shiv Kumar 等 Nucleosides，Nucleotides&Nucleic Acids， 2005,24,401 ;)，但往往都存在合成方法不直接、长链合成困难等问题。因而，一方面，我们 要开发新的合成具有更长的多聚磷酸链的末端标记核苷酸分子的方法，另一方面，选择吸 光系数、量子产率高，淬灭效果好，激发波长适合的荧光分子也是本发明的重要方面。
【发明内容】
[0005] 本发明涉及一类5'-末端磷酸荧光标记的核苷酸，提供了分子结构及合成方法。 该类分子可以更好地被DNA聚合酶所识别，且在被聚合酶识别并反应结合之后在碱性磷酸 酶协助下快速实现荧光信号由关闭向开启状态转变，从而作为聚合酶底物可以被应用于核 酸序列测定等等领域中。
[0006] 本发明提供一种末端磷酸荧光标记的核苷酸结构，具有如下通式（1)所示结构
[0007]
[0008] 其中Ra，Rb可以独立的选自-H，-OH ;n为大于等于1，并且小于等于5的整数；
[0009] 其中，通式（1)中的荧光基团具备下面通式（2)所述结构，
[0010]
[0011] 其中，通式（2)中R1, R5可独立的选自-H、氟、氯、溴、芳基、取代芳基、C1-C6烷基、 取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、取代的C1-C6烷氧基；
[0012] R2_4, R6_8, R9_n可以独立的选自-H、氟、氯、溴、芳基、取代芳基、杂芳基、-CO 2H、-CO2R 、-503!1、-5031?、-〇]2〇)2!1、-〇1 2〇)21?、-〇^03!1、-〇125031?、-〇1 2剛2、-(^順1?、-勵2、(：1-〇6烷基、取代 的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、取代的C1-C6烷氧基、C1-C6烷氧基芳基、取代的C1-C6烷氧 基芳基、苯基、取代苯基、联苯基、取代联苯基、苄基、取代苄基、苯甲酰基、取代苯甲酰基，其 中R选自C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、取代的C1-C6烷氧基、C1-C6烷氧 基芳基、取代的C1-C6烷氧基芳基、苯基、取代苯基、联苯基、取代联苯基、苄基、取代苄基、 苯甲酰基、取代苯甲酰基。
[0013] 同时，本发明提供一种合成末端磷酸荧光标记的核苷酸结构的方法，其特征在于 包括以下步骤：
[0014] (a)三偏磷酸盐与荧光染料基团的羟基反应，生成荧光基团修饰的三偏磷酸中间 体；
[0015] (b)选用带有Y -磷酸链的核苷与荧光基团修饰的三偏磷酸中间体反应，转化成 产物5'-多聚磷酸末端荧光标记核苷酸。
[00161
[0017] 其中，所述的末端磷酸荧光标记的核苷酸结构具有如下通式（1)所示结构
[0018]
[0019] 其中Ra，Rb可以独立的选自-H，-OH ;n为大于等于1，并且小于等于5的整数。本 发明提供的合成末端磷酸荧光标记的核苷酸结构的方法，其对于荧光分子并没有特殊的要 求，比如含有羟基的氧杂蒽类、香豆素、试卤灵类荧光分子。
[0020] 根据本发明的优选的实施方式，所述的荧光基团优选通式（2)所述的结构。
[0021] 根据本发明的另一个优选的实施例，η值为3、4或5。
[0022] 其中，通式（1)中碱基可以选自腺嘌呤（Α)、鸟嘌呤（G)、胞嘧啶（C)、胸腺嘧啶 (T)、尿嘧啶（U)、修饰的核苷碱基或非天然的核苷碱基。
[0023] 根据本发明的优选的实施方式，合成末端磷酸荧光标记的核苷酸结构方法的步骤 (a)中，三偏磷酸盐在活化试剂存在下被活化，再与荧光染料基团的羟基反应，生成中间体 荧光基团修饰的三偏磷酸。活化试剂可以为酰氯，磺酰氯，氯化砜，氯化亚砜，二氯亚砜等.
[0024] 根据本发明的优选的实施方式，合成末端磷酸荧光标记的核苷酸结构方法中，所 述核苷酸结构为W -脱氧核苷Y -单磷酸（dNMP)、2^ -脱氧核苷Y -二磷酸（dNDP) 或者W -脱氧核苷Y -三磷酸（dNTP)。
[0025] 根据本发明另一个优选的实施例，所述荧光基团对应的荧光分子为以下结构，
[0026]
[0027] 根据本发明的优选的实