物TG的方法、条件都 属于常规技术。并且，在本实施例的基础上，获得实施例1所述其它取代基的化合物属于有 经验的本领域化学合成人员可以做到的。
[0054] 实施例4.
[0055] 合成5' -ζ-末端磷酸荧光标记的2'-脱氧核苷六磷酸酯
[0056] 1)合成染料三偏磷酸酯活性中间体
[0057]
[0058] 取三偏磷酸钠（355mg，I. 16mmol)溶于适量去离子水，此溶液经过离子交换柱 (BioRad AG-50W-XB阳离子交换树脂）处理置换为三偏磷酸三丁基胺盐，将此胺盐的水溶 液经冷冻干燥，再经油泵真空抽干12h，得到干燥的三偏磷酸三丁基胺盐固体。在氩气氛围 下，将此固体放入干燥的25mL圆底反应瓶中，向此反应瓶中加入无水干燥的IOmL乙腈溶 液，将此溶液在搅拌情况下冷却（冷却10~-KTC，这里选0°C )，向溶液中滴加入二氯亚 砜（109uL)以及DMAP (对二甲氨基吡啶）（8mg)，随后加入430mg三丁基胺。随后此溶液在 〇°C下搅拌1~30分钟，然后将荧光标记染料l(167mg，0. 5mmol)加入到上述反应液中，该 混合反应液在〇°C到室温的条件下搅拌反应1~5小时，直至HPLC检测大部分的荧光染料 原料消失即可停止反应，此溶液包含中间体化合物2。该溶液可保存在-20°C冰箱中待用。
[0059] 2)合成5' -ζ-末端磷酸荧光标记的2'-脱氧核苷六磷酸酯
[0060]
[0061] 取2'-脱氧腺苷-5'-三磷酸二钠盐（50umol)溶于Iml去离子水溶液，将此 溶液经过离子交换柱（BioRad AG-50W-XB阳离子交换树脂）处理，转换为V -脱氧腺 苷-5'-三磷酸三丁胺盐的水溶液，此水溶液经过高真空下低温旋转蒸发除掉绝大部分水 溶液，剩下的溶液加入ImL无水干燥的DMF，再次在高真空下低温旋转蒸发除去溶剂，此过 程再重复两次，然后将此除去水的2'-脱氧腺苷-5'-三磷酸三丁胺盐溶于2mL的无水 干燥DMF，在室温搅拌情况下，将步骤1)中得到的荧光标记的三偏磷酸中间体2的乙腈溶 液2mL通过注射器抽取并添加到此反应液中，随后加入无水MgBr2 · Et20(0. 4umol)的DMF 溶液，此混合物在室温下搅拌反应8-24小时，反应进程使用HPLC跟踪检测，待产物峰不再 增加，即可停止反应。将此反应液在高真空下低温旋转蒸发除去绝大部分的DMF溶剂，再 将残留物溶于3mL的IOOmM的醋酸三乙胺缓冲液（PH 7. 6)，此溶液经反相分离色谱分离提 纯，采用Agela中压制备色谱仪，AQ C-18-60g制备柱分离。梯度洗脱：流动相A为50mM 醋酸三乙胺缓冲液，PH为7. 5 ;流动相B为色谱纯乙腈，洗脱程序为：0-15min由A增加到 20 % B，15-35min B成分增加到40 %，流速15mL/min，收集含有目标成分馏分，减压浓缩， 经高效液相色谱分析纯度约90%，精细的分离纯化采用高效液相色谱系统，Inertsil C18 半制备柱分离纯化，流速为3mL/min，流动相A为50mM醋酸三乙胺缓冲液，PH为7. 5 ;流动 相B为色谱纯乙腈，梯度洗脱程序为：0-15min由A增加到20% B，15-25min由B成分增 加到30%，25-35min增加到50%。收集纯产物馏分，低温浓缩，测定浓度后放置于-20°C 冰箱中保存备用。纯品经MALDI-T0F质谱分析，目标产物dA6P ^ (或简称TG-dA6P)分子 组成及计算值 C31H33N5024P6, m/zl045. 9975.实测值（负离子模式）1045. 1721 (M-H)， 1067. 1470 (M+Na-2H)，1083. 1217 (M+K-2H)。该 2'-脱氧核苷六磷酸酯产率约为 68%。
[0062] 其他三种V -ζ-末端磷酸荧光标记的V -脱氧核苷六磷酸酯（TG-dG6P， TG-dC6P，TG-dT6P)按照本实施例4所述方法分别合成。其结构如下：
[0063]
[0064]
MU_
[0065] 实施例5
[0066] 5' - δ -末端磷酸荧光标记的2'-脱氧核苷四磷酸酯的合成按照本实施例4所 述方法进行，只需将2'-脱氧核苷-5'-三磷酸钠盐替换为2'-脱氧腺苷-5'-单磷 酸钠盐。
[0067] 实施例6
[0068] 5' - ε -末端磷酸荧光标记的2'-脱氧核苷五磷酸酯的合成按照本实施例4所 述方法进行，只需将2'-脱氧核苷-5'-三磷酸钠盐替换为2'-脱氧腺苷-5'-二磷 酸钠盐。
[0069] 实施例7
[0070] 根据实施例4所述四种5' - ζ -末端磷酸荧光标记的核苷六磷酸酯（TG-dN6P)在 DNA序列测定方面的应用。
[0071] 首先将用于序列测试的SsDNA模板通过不对称固相PCR的方式固载到玻璃芯片表 面上：将芯片表面已经种植有引物的通道内注入PCR混合液，其中包括IuM的引物I ;125nM 的引物 2 ;100nM 的 DNA 模板；0· 3U/uL 的 DNA 聚合酶（Platinum Taq(Life technology))， 3mM的镁离子，Ix标准Taq缓冲液。先做15~20个循环的预扩增（95°C 30s，65°C 15s， 72°C 45s)，以产生足够多的单链DNA模板，然后作20~30个循环的扩增（95°C 30s，65°C， 150s)以便预扩增的ssDNA与芯片表面引物退火并有效延伸。PCR之后，纯水清洗芯片表面 lOmin，最终获得约含有5fmol/_2待测序列浓度的芯片表面。
[0072] 测序开始前，将四种5 ' - ζ -末端磷酸荧光标记的2 '-脱氧核苷六磷酸酯 T6-dN6P分别单独放置于4°C冷却的样品瓶中并稀释至luM(使用缓冲液为50mM Tris-HCl pH 7.9,50mM NaCl，0.1%tween-20，lmM MnC12，lmM DTT)，同时样品瓶中也包括碱性磷酸 酶（CIP)，DNA聚合酶（Bst)。测序时，每一次向芯片通道中加入一种TG-dN6P，然后升温至 65°C引发聚合酶工作，释放出带有荧光标记的多聚磷酸片段链，碱性磷酸酶快速分解此多 聚磷酸链并释放出荧光染料核心分子，聚合反应完成后降低温度至室温，在激发光下产生 荧光信号，该信号与聚合酶正确识别和结合到模板上的碱基数量呈线性关系。完成信号拍 照采集后冲洗芯片通道（50mM Tris-HCl pH 7. 9,50mM NaCl，0.1% tween-20, ImM EDTA， ImM DTT)，进行下一个标记底物TG-dN6P的加入，如此完成依次循环进行，直到测序完成。 本测序方法并不局限特定的序列，只需要根据实际样品来源进行相应的建库处理，并在特 定的反应芯片上进行表面样品扩增即可。本方法具有测序反应周期短（每轮反应及信号采 集不超过3分钟），焚光信号强（处于末端磷酸标记状态下的焚光分子量子产率和吸光系 数非常低，因此荧光背景极低，而被磷酸酶分解释放后的荧光分子量子产率和吸光系数很 高），准确度高，读长较长等特点。本发明中，所有的无水操作都是在氩气或其它惰性气体保 护下、经过烘干的反应器中进行。所用到的化学原料、试剂、溶剂等如不特别说明，均表示为 直接购买的分析纯或化学纯试剂。反相制备色谱使用Agela Cheetah-2中压制备色谱仪， Agela AQ C-18制备柱分离。反相分析色谱使用岛津LC-20A液相色谱系统。样品纯度分析 使用 Inertsil ODS-3 C18 色谱柱（250X4. 6mm，5ym)。流速为 lmL/min，流动相 A 为 50mM 醋酸三乙胺缓冲液，PH为7. 5 ;流动相B为色谱纯乙腈，梯度洗脱程序为：0-15min由A增加 到20% B，15-25min由B成分增加到30%。
[0073] 实施例8
[0074] 根据实施例5所述的2'-脱氧核苷四磷酸酯，在实施例7所述的相同测序条件下 用作基因测序，其测序反应速度（每一轮测序反应完成所需要的时间）要慢于TG-dN6P，在 整体结果上表现为获得相同读长所需的样品测序时间更长，其原因为聚合酶对带有不