同长 度磷酸链的核苷酸的识别和结合速度不同，并由此影响到测序准确度以及反应时间延长造 成的错配等误差增加。
[0075] 实施例9
[0076] 在实施例4的基础上，如果荧光分子的活性链接基团由羟基改为氨基或者其他基 团，则所形成的末端磷酸荧光标记的核苷酸结构不能被磷酸酶所切除，因而无法释放荧光 分子，导致不能产生荧光信号。
[0077] 本发明的【具体实施方式】是对于本发明技术方案的进一步描述，是为了更好的描述 本发明要求保护内容的效果而选择的，并不是对于
【发明内容】
的限制。其步骤、参数等，比如 实施例4中具体参数是本领域技术人员根据本发明的构思可以选择的。
【主权项】
1. 一种末端磷酸荧光标记的核苷酸结构，其特征在于：具有如下通式（1)所示结构其中Ra，Rb可以独立的选自-H，-OH;n为大于等于1，并且小于等于5的整数； 其中，通式（1)中的荧光基团具备下面通式（2)所述结构，其中，通式（2)中Ri，R5可独立的选自-H、氟、氯、溴、芳基、取代芳基、C1-C6烷基、取代 的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、取代的C1-C6烷氧基； 馬-4，&-8，馬-11可以独立的选自-瓜氟、氯、溴、芳基、取代芳基、杂芳基、-(：0 211、-〇)21?、-50 3H、-S03R、-CH2C02H、-CH2C02R、-CH2S03H、-CH2S03R、-CH2NH2、-CH2NHR、-N02、C1-C6 烷基、取代的 C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、取代的C1-C6烷氧基、C1-C6烷氧基芳基、取代的C1-C6烷氧基 芳基、苯基、取代苯基、联苯基、取代联苯基、苄基、取代苄基、苯甲酰基、取代苯甲酰基，其中 R选自C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、取代的C1-C6烷氧基、C1-C6烷氧基 芳基、取代的C1-C6烷氧基芳基、苯基、取代苯基、联苯基、取代联苯基、苄基、取代苄基、苯 甲酰基、取代苯甲酰基。2. -种合成末端磷酸荧光标记的核苷酸结构的方法，其特征在于包括以下步骤： (a) 三偏磷酸盐与荧光染料基团的羟基反应，生成中间体荧光基团修饰的三偏磷酸中 间体； (b) 选用带有5 磷酸链的核苷与荧光基团修饰的三偏磷酸中间体反应，转化成产物 5 ^ -多聚磷酸末端荧光标记核苷酸； 其中，所述的末端磷酸荧光标记的核苷酸结构具有如下通式（1)所示结构其中Ra，Rb可以独立的选自-H，-OH;n为大于等于1，并且小于等于5的整数。3. 根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，通式（1)中的荧光基团具备下面通式 (2)所述结构，其中，通式（2)中Ri，R5可独立的选自-H、氟、氯、溴、芳基、取代芳基、C1-C6烷基、取代 的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、取代的C1-C6烷氧基； 馬-4，&-8，馬-11可以独立的选自-瓜氟、氯、溴、芳基、取代芳基、杂芳基、-(：0 211、-〇)21?、-50 3H、-S03R、-CH2C02H、-CH2C02R、-CH2S03H、-CH2S03R、-CH2NH2、-CH2NHR、-N02、C1-C6 烷基、取代的 C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、取代的C1-C6烷氧基、C1-C6烷氧基芳基、取代的C1-C6烷氧基 芳基、苯基、取代苯基、联苯基、取代联苯基、苄基、取代苄基、苯甲酰基、取代苯甲酰基，其中 R选自C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、取代的C1-C6烷氧基、C1-C6烷氧基 芳基、取代的C1-C6烷氧基芳基、苯基、取代苯基、联苯基、取代联苯基、苄基、取代苄基、苯 甲酰基、取代苯甲酰基。4. 根据权利要求1或2所述的内容，其特征在于，n值为3、4或5。5. 根据权利要求1或2所述的内容，其特征在于， 通式（1)中碱基可以选自腺嘌呤（A)、鸟嘌呤（G)、胞嘧啶（C)、胸腺嘧啶（T)、尿嘧啶 (U)、修饰的核苷碱基或非天然的核苷碱基。6. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于， 所述步骤（a)中，三偏磷酸盐在活化试剂存在下被活化，再与荧光染料基团的羟基反 应，生成中间体荧光基团修饰的三偏磷酸。活化试剂可以为酰氯，磺酰氯，氯化砜，氯化亚 砜，二氯亚砜等.7. 根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，所述核苷酸结构为2 '-脱氧核 苷-5'-单磷酸（dNMP)、〗'-脱氧核苷-5'-二磷酸（dNDP)或者2'-脱氧核苷 5 '-三磷酸（dNTP)。8. 根据权利要求1或2所述的内容，其特征在于，所述荧光基团对应的荧光分子为以下 结构，9. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，首先将荧光基团与活化的三偏磷酸反应， 生成荧光基团三偏磷酸复合物中间体，再与核苷5 单磷酸或者核苷5 二磷酸或者 核苷5 ^ -三磷酸或者5 ^ -多磷酸反应。10. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，其中所述方法不包括所述核苷的氨基和 /或羟基的保护和/或去保护。11. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法为一锅式反应，中间不需要分 离纯化所述中间体。12. 根据前面任一项权利要求所述的内容，其特征在于，所述末端磷酸荧光标记的核苷 酸结构可以作为DNA或RNA聚合酶底物，被DNA或RNA聚合酶识别并掺入到DNA或RNA链 中去，并释放出焚光基团标记的多聚磷酸分子。13. 根据权利要求12所述的内容，其特征在于，所述末端磷酸荧光标记的核苷酸结构 可以作为碱性磷酸酶的底物被继续分解，直至全部磷酸基团从荧光分子上脱离。14. 根据前面任一项权利要求所述的内容，其特征在于，所述末端磷酸荧光标记的核苷 酸结构在被分解并释放出荧光基团之前为荧光关闭状态，被激发光照射时不显著发出荧光 信号。15. 根据前面任一项权利要求所述的内容，其特征在于，所述末端磷酸荧光标记的核 苷酸结构被聚合酶和碱性磷酸酶分解后释放出荧光基团，在激发光照射时显著发出荧光信 号。16. 根据前面任一项权利要求所述的内容，其特征在于，所述荧光基团的激发光波长范 围为470-535nm，发射光波长范围为510-570nm。17. 根据前面任一项权利要求所述的内容，其特征在于，式（1)所述末端磷酸荧光标记 的核苷酸结构为5末端磷酸荧光标记的核苷酸六磷酸酯、5末端-n-磷酸荧 光标记的核苷酸七磷酸酯或者5 '-末端-0 -磷酸荧光标记的核苷酸八磷酸酯。18. -种末端磷酸荧光标记的核苷酸分子，其特征在于，荧光基团连接6-8个磷酸分 子，然后依次连接到核糖以及碱基； 其中所述荧光标记的核苷酸分子是通过三偏磷酸盐与荧光染料基团的羟基反应，然后 再与带有5 '-磷酸链的核苷发生反应获得的； 所述末端磷酸荧光标记的核苷酸分子可以被DNA聚合酶所识别，并且在反应结合之后 在碱性磷酸酶协助下可以实现荧光信号由关闭向开启状态转变。19. 一种末端磷酸焚光标记的核苷酸分子的合成方法，其特征在于，焚光基团连接6-8 个磷酸分子，然后依次连接到核糖以及碱基； 其中所述荧光标记的核苷酸分子是通过三偏磷酸盐与荧光染料基团的羟基反应，然后 再与带有5 '-磷酸链的核苷发生反应获得的； 所述末端磷酸荧光标记的核苷酸分子可以被DNA聚合酶所识别，并且在反应结合之后 在碱性磷酸酶协助下可以实现荧光信号由关闭向开启状态转变。20. 根据前面任一项权利要求所述的内容，其特征在于，所述末端磷酸荧光标记的核苷 酸结构为6磷酸结构或者7磷酸结构或者8磷酸结构。21. -种利用末端磷酸荧光标记的核苷酸结构进行基因测序的方法，其特征在于所述 核苷酸结构为权利要求1-18中任一项限定的核苷酸结构。
【专利摘要】本发明涉及一类5′-末端磷酸荧光标记的核苷酸，提供了分子结构及合成方法。该类分子可以更好地被DNA聚合酶所识别，且在被聚合酶识别并反应结合之后在碱性磷酸酶协助下快速实现荧光信号由关闭向开启状态转变，从而作为聚合酶底物可以被应用于核酸序列测定等等领域中。
【IPC分类】C07H19/10, C09K11/06, C07H1/00, C07H19/207, C12Q1/68
【公开号】CN104910229
【申请号】CN201510212788
【发明人】段海峰, 黄岩谊, 陈子天, 谢晓亮
【申请人】北京大学
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年4月30日