抗结核药物及抗结核药物筛选方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及抗结核药物以及抗结核药物筛选方法，本发明还涉及含有该抗结核药 物的组合物，以及该抗结核药物用于制备预防或治疗结核病的药物的用途。
【背景技术】
[0002] 近年来结核病感染人数逐年攀升，2012年全球结核病新增860万人，结核病死亡 人数约130万人 [1];中国是高结核病负担国家，多药耐药结核病以及与HIV结合感染情况的 增加，使结核病疫情的防控面临着更为严峻的挑战。快速研发新型抗结核药物解决结核病 治疗所面临的难题成为控制结核病疫情的当务之急。
[0003] 针对已经确认的靶点寻找全新结构抗结核新药是最快捷而有效的途径。丙氨酸消 旋酶（alanine racemase，ALR)是已经确认的抗结核药物祀点，该酶可以催化L-丙氨酸与 D-丙氨酸之间相互转化[2'3]。D-丙氨酸是菌体细胞壁中肽聚糖合成的必需前体物质，而自 然界中只存在天然来源的L-丙氨酸，因此L-丙氨酸进入菌体后必须通过ALR的催化作用 生成D-丙氨酸，用于细胞壁的合成 [4]。
[0004] ALR广泛存在于原核细胞中，且在不同的生物体中的相似性较高，氨基酸序 列覆盖率为35%-50%，在部分细菌中存在两个编码基因 air和dadX，而结核分枝杆菌 (Mycobacterium tuberculosis，MTB)的基因组中只存在一个ALR的编码基因 alr[5]。由于 人体细胞中不存在ALR，所以针对ALR靶点的抗菌药物在人体中具有高度的选择性。
[0005] ALR属于5-磷酸批卩多醒（pyridoxal5' -phosphate, PLP)依赖型的异构酶家族， 其活性构型是由两个43kD的单体组合而成的二聚体结构，每个单体中含有两个活性结 合位点：即PLP结合位点和丙氨酸结合位点[ 6]，已经发现的ALR抑制剂中多数是以PLP 结合位点为靶点的竞争性抑制剂，由于原核生物中PLP依赖型的酶普遍存在[7_8]，所以 以ALR为靶点的药物很可能是多靶点的。目前，作用于ALR的抗结核药物D-环丝氨酸 (D-cycloserine，DCS)已应用于临床，但DCS对ALR的抑制活性偏低，且DCS对人体有较大 的毒副作用 [9]，对于DCS的结构改造也没有明显的改善其毒性[1(H11]。因此，针对ALR靶点 建立新的抗结核药物筛选模型以及寻找不同作用机制的新型抗结核药物具有重要的意义。
【发明内容】
[0006] 本发明的发明人通过大量实验和反复摸索，建立了以丙氨酸消旋酶为靶点的抗结 核药物筛选模型，并筛选出了具有较好抗结核活性、抗菌谱广、细胞毒性低的抗结核药物。
[0007] 本发明第一方面涉及式I所示的化合物，或其药学上可接受的盐。
[0008]
[0009] 本发明第二方面涉及药物组合物，其含有本发明第一方面任一项的化合物或其药 学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体或赋形剂。
[0010] 本发明第三方面涉及本发明第一方面任一项的化合物或其药学上可接受的盐在 制备抗结核药物中的用途。
[0011] 本发明还涉及本发明第一方面任一项的化合物或其药学上可接受的盐在体内/ 体外作为丙氨酸消旋酶抑制剂的用途，优选地，所述丙氨酸消旋酶为分枝杆菌的丙氨酸消 旋酶，更优选地，所述丙氨酸消旋酶为结核分枝杆菌的丙氨酸消旋酶。
[0012] 本发明还涉及本发明第一方面任一项的化合物或其药学上可接受的盐在体内/ 体外用于抑制分枝杆菌活性的用途，优选地，所述分枝杆菌为结核分枝杆菌。
[0013] 在本发明的实施方案中，所述结核分枝杆菌为H37RV。
[0014] 本发明还涉及本发明第一方面任一项的化合物或其药学上可接受的盐在制备抗 分枝杆菌药物的用途，优选地，其中所述分枝杆菌为结核分枝杆菌。
[0015] 在本发明的实施方案中，所述结核分枝杆菌为H37RV。
[0016] 本发明还涉及本发明第一方面任一项的化合物或其药学上可接受的盐在制备预 防或治疗结核病的药物中的用途。
[0017] 在本发明的实施方案中，其中所述的结核病为肺结核或肺外结核(例如骨关节结 核、结核性脑膜炎、结核性胸膜炎、肾结核、肠结核等)。
[0018] 本发明还涉及一种筛选抗结核药物的方法，所述方法包括以下步骤：
[0019] (1)建立反应体系，所述反应体系中包括烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD)、丙氨酸脱 氢酶（ALD)、D-丙氨酸、丙氨酸消旋酶（ALR)、待测样品以及反应缓冲液，同时设立阳性对照 和阴性对照，该反应体系在一定温度下反应一定时间；
[0020] (2)通过检测反应产物还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH)的浓度计算酶的反应 速率，并根据酶的反应速率计算得到待测样品对丙氨酸消旋酶的抑制率，选择抑制率> 50% 的样品作为抗结核药物；
[0021] (3 )任选地，可以重复进行步骤（1)和（2 )。
[0022] 在本发明的实施方案中，其特征在于以下（1)~（8)项中的一项或多项：
[0023] (1)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的反应浓度为5-20mmol/L，例如8-12mmol/L，例如 10mmol/L ；
[0024] (2)丙氨酸脱氢酶的浓度为0.025-0. 15U/ml，例如为0.05-0. 10U/ml，例如为 0.08U/ml ；
[0025] (3) D-丙氨酸的浓度为 5_20mmol/L，例如 8_12mmol/L，例如 10mmol/L ;
[0026] (4)丙氨酸消旋酶的浓度为2. 1-8. 4υ/100μ 1，例如为3. 8-4. 6υ/100μ 1，例如为 4. 2U/100y 1 ；
[0027] (5)步骤（1)中的反应温度为34-40°C，例如为36-38°C，例如为37°C ;
[0028] (6)步骤（1)中的反应时间为30-50min，例如为40min ;
[0029] (7)步骤（1)中的反应pH值为7. 0-9.0,例如为8. 5-9.0 ;
[0030] (8)步骤（1)中的反应缓冲液为Tris-HCl缓冲液或PBS缓冲液。
[0031] 在本发明的具体实施方案中，所述阳性对照药物为作用于丙氨酸消旋酶的抑制 剂，例如为D-环丝氨酸。
[0032] 在本发明的实施方案中，所述阴性对照药物为溶解药物的溶剂。在本发明的具体 实施方案中，所述阴性对照药物为DMS0。
[0033] 在本发明的实施方案中，所述反应缓冲液可以为本领域常用的缓冲溶液，例如为 Tris-HCl缓冲液或PBS缓冲液。在本发明的具体实施方案中，所述缓冲液为Tris-HCl缓冲 液。在本发明的具体实施方案中，Tris-HCl缓冲液的浓度为100mm 〇l/L，pH为8. 0。
[0034] 在本发明的实施方案中，反应体系的体积为100 μ 1。
[0035] 在本发明的实施方案中，所述酶的抑制率（IR%)的计算方法为：
[0036] IR (%) = (1_VS/VN) X 100%，其中Vs代表待测样品孔的酶反应速率，Vn代表阴性对 照孔的平均酶反应速率。
[0037] 在本发明的实施方案中，所述酶的反应速率的计算方法为：
[0038] V= (Qt2-Qtl) AVt1)，其中Q为反应体系中生成的产物浓度，&和t2为反应在线性 范围内的两个时间点。
[0039] 发明的有益效果
[0040] 本发明以丙氨酸消旋酶为靶点构建了抗结核药物筛选模型，利用该模型成功地筛 选出抗结核药物，为更多新抗结核药物的筛选奠定了基础。同时，筛选出的药物具有较好的 抗结核活性，且抗结核菌谱广，细胞毒性低。
【附图说明】
[0041] 图Ialr的PCR扩增结果，I :DNA分子量标准，2 :alr的PCR产物
[0042] 图 2pET28a: :alr 的双酶切验证，I :DNA 分子量标准；2 :pET28a: :alr 经 EcoRI 和 HindIII双酶切
[0043] 图 3ALR SDS-PAGE 蛋白图谱，I :Fermentas#SM0671marker ;2 :全蛋白；3 :沉淀；4 : 上清；5 :流川液；6-7 :杂质峰；8-10 :纯化的ALR蛋白
[0044] 图4NADH浓度与OD34tl关系
[0045] 图5ALR的稳定性
[0046] 图6筛选条件优化，A:最适温度；B:最适pH ;C:最佳D-alanine浓度；D:最佳NAD 浓度；E:最佳LAD浓度；F:最佳酶量；G = DMSO浓度对酶活的影响
【具体实施方式】
[0047] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会 理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体 条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为 可以通过市购获得的常规产品。
[0048] 实施例1MTB ALR的表达载体的构建
[0049] 以 MTB H37Rv 基因组为模板，以 ALR-PF :5' CGGGAATTCATGAAACGGTTCTGGGAGAATGT CGGAAAGC3'（SEQ ID NO :1)和 ALR-PR :5' CATAAGCTTACCACGGTTTTCAGCCTCGCGATAGGTCCT3' (SEQ ID N0:2)为引物(下划线为酶切位点)，进行PCR扩增，条件为：95°C预变性5min;9