极易受成纤维细胞污染，从而无法用于临床药敏试验的问题，提出了一种可用于药敏试验的高纯度批量乳腺癌原代肿瘤活细胞快速分离的方法。该方法通过机械振荡、反复吹打的方法实现，不仅可以批量快速分离高纯度乳腺癌原代肿瘤活细胞，同时能够进一步运用于临床药敏试验中。本发明的方法可为临床药敏试验提供可靠的研究对象，同时可为原代肿瘤细胞DNA、RNA和蛋白的建库以及为肿瘤在体研究提供新的方法和更广阔的材料来源。
[0026]本发明基于如下现状:
[0027]准确的肿瘤药敏试验对治疗和预后判断至关重要。然而肿瘤组织中除了肿瘤细胞还有很多间质和炎症细胞。若直接用手术切除组织做药敏试验，非肿瘤细胞的存在将严重影响药敏试验结果的准确性。目前国内外在肿瘤细胞药敏实验中广泛采用的单细胞分离技术为胶原酶消化分离技术，用该技术分离到的单细胞大多数为肿瘤组织中的成纤维细胞。因为国内外现有的技术方法无法批量快速分离得到高纯度原代肿瘤细胞。如直接用手术切除组织做药敏试验，非肿瘤细胞的存在将严重影响药敏试验结果的准确性；传统酶消化法获取的单细胞多为成纤维细胞，会造成药敏试验假阳性；若通过多次传代后挑取肿瘤细胞克隆，耗时3-4周，且因长时间体外培养后可能会改变肿瘤细胞的生物学行为，无法满足临床快速诊断的要求；显微切割技术(Lasercapturemicrodissect1n, LCM)虽然可以快速准确地从组织中捕获目的细胞，但不能从组织中捕获活细胞，所以不能用于细胞培养和药敏实验；且捕获时激光可能破坏RNA完整性，会影响后续的实验结果，而且由于LCM获得的细胞数量少，无法进行后续实验和蛋白质分析实验。
[0028]因此，本申请提供了用于临床药敏试验的高纯度批量原代肿瘤活细胞快速分离方法，获得的高纯度批量原代肿瘤活细胞对于临床肿瘤个性化治疗的具有至关重要的临床意义。
[0029]乳腺癌是导管上皮或腺上皮细胞来源的肿瘤，在乳腺癌中E-cadherin失活，从而使得细胞间连接减少，最终造成癌细胞脱落并产生种植或转移。本发明利用癌细胞粘附性差这一生物学特点，建立了通过机械震荡达到批量快速分离高纯度乳腺癌原代肿瘤活细胞的方法。该方法能从乳腺癌组织块中分离活的乳腺癌细胞，肿瘤细胞纯度可达90%以上。
[0030]更具体的，本发明的快速分离乳腺癌原代肿瘤活细胞方法，其特征在于，其包括步骤:
[0031 ] I)获得离体的乳腺癌患者新鲜的组织样品；
[0032]2)组织样品前处理和质控；
[0033]3)高纯度批量乳腺癌原代肿瘤活细胞快速分离。
[0034]本发明中，所述的新鲜的组织样品包括:未经中性福尔马林固定的手术切除组织和穿刺组织。
[0035]本发明中，所述的组织样品前处理由特定的专业人员质控，通常，所述的特定的专业人员选自病理科医生。
[0036]本发明中，将获得的手术切除离体的新鲜的组织样品制成细小组织块，用培养液清洗并反复吹打；静置、移出上清、离心、弃去上清；重悬细胞沉淀；进一步用显微镜观察所获得的细胞，并拍照；用于药敏试验。
[0037]本发明的实施例中采用以下步骤实现高纯度批量乳腺癌原代肿瘤活细胞快速分离:
[0038]I)获取新鲜乳腺癌标本
[0039]手术室获取新鲜乳腺癌标本，立即送病理科；
[0040]2)预处理获取的新鲜乳腺癌标本
[0041]由病理科医生在手术切除新鲜组织标本非坏死区域且含肿瘤组织较多的区域，切取Icm3大小组织块；
[0042]3)预处理获取的组织块制备冰冻切片和HE染色
[0043]预处理获取的组织块同时做冰冻切片和HE染色做质量控制，以保证肿瘤细胞含量达到75%以上；
[0044]4)将组织块切割成Imm3大小的组织碎片；
[0045]5)用1ml含有庆大霉素的199培养液清洗组织两遍，并反复吹打2分钟；
[0046]6)将步骤5)所述含组织的1ml的199培养液移至15ml离心管中并静置I分钟；
[0047]7)小心地移出上清至另一个干净的15ml离心管中，避免吸取底部的组织块；
[0048]8)将步骤7)获取的上清按1000RPM的速度离心5分钟，并小心弃去上清；
[0049]9)用1ml的Ham’ sF_12培养液重悬步骤7)获得的细胞沉淀，
[0050]所述的Ham’ sF_12培养液中含5%FBS，I μ g/ml胰岛素和I μ g/ml氢化可的松；
[0051]10)将上步骤获得的细胞移至培养皿或96孔板中，在37oC，9%C02的环境下培养；
[0052]11)显微镜观察所获得的细胞，并拍照；
[0053]12)分离第二天即换液，之后每隔三天换一次培养液。
[0054]观察结果显示，本方法分离获得的细胞中所含成纤维细胞少，肿瘤细胞含量高且呈半悬浮状态，批培养一周后发现，其中90%以上为肿瘤细胞，并且肿瘤细胞成克隆性生长，未见明显梭形的成纤维细胞。可进一步用于药敏试验。
[0055]本发明通过附图和实施例进一步描述，所述实施例只是例证了本发明的具体实施方案，证实本发明所涉及方法的有效性，无以任何方式限制本发明范围之意。
【附图说明】
[0056]图1是本方法分离获得的原代乳腺癌细胞，X 400，
[0057]其中，批量快速分离乳腺癌原代肿瘤活细胞并培养一周后发现，其中90%以上为肿瘤细胞，并且肿瘤细胞成克隆性生长，未见明显梭形的成纤维细胞。
【具体实施方式】
[0058]实施例1样本收集
[0059]本发明在实施过程中用到的所有样品均来源于乳腺癌患者的手术切除标本，所有参与患者对科学研究都知情同意。
[0060]用于本发明的检测样品通常以临床可以接受的方式收集，优选以核酸(特别是RNA)或蛋白质被保护的方式收集。
[0061]患者资料(年龄、性别、影响报告、治疗过程、其他医疗状况、家族史等)得自医院数据库，用于匹配所收集的各种样品。病理学跟踪研究(例如通过苏木素和伊红染色，即H&E染色进行组织学分析)用于明确给定样品的疾病状态以及保证样品的一致分级。
[0062]手术室获取新鲜乳腺癌标本，立即送病理科。
[0063]实施例2:纟目织前处理
[0064]由病理科医生在待检测样品的非坏死区域且含肿瘤组织较多的区域，切取lcm3大小组织块。同时，该组织块做冰冻切片和HE染色做质量控制，以保证肿瘤细胞含量达到75%以上。将组织至于1ml含有庆大霉素的199培养液中，可冰上保存24小时以便标本运输。
[0065]实施例3:高纯度原代乳腺癌细胞快速批暈分离
[0066]将Icm3大小乳腺癌组织块切割成Imm3大小的组织碎片，用1ml含有庆大霉素的199培养液清洗组织两遍，并反复吹打2分钟，将含组织的1ml的199培养液移至15ml离心管中并静置I分钟，小心地移出上清至另一个干净的15ml离心管中，且避免吸取底部的组织块，将上述获取的上清按照1000RPM的速度离心5分钟，并小心弃去上清，用1ml的Ham’ sF-12培养液重悬细胞沉淀，其中Ham’ sF-12培养液中含5%FBS，I μ g/ml胰岛素和I μ g/ml氢化可的松，将所获得的细胞移至培养皿中，在37oC，9%C02的环境下培养，用显微镜观察所获得的细胞，用台盼蓝计数并拍照；检测结果显示，本发明共分离获得2xl06的原代乳腺癌细胞，其中90%以上为肿瘤细胞及肿瘤细胞克隆，未见明显梭形的成纤维细胞；分离第二天即换液，之后每隔三天换一次培养液。
【主权项】
1.一种快速分离乳腺癌原代肿瘤活细胞方法，其特征在于，其包括:获得离体的乳腺癌患者新鲜的组织样品；组织样品前处理和质控；高纯度批量乳腺癌原代肿瘤活细胞快速分离；通过下述步骤: 1)取离体的新鲜的乳腺癌组织标本进行前处理， 由所述组织标本非坏死区域且含肿瘤组织多的区域，切取Icrn3大小组织块； 2)将前处理的组织块制备冰冻切片和HE染色及质量控制， 3)将上述组织块切制成Imm3大小的组织碎片； 4)用1ml含有庆大霉素的199培养液清洗组织两遍，并反复吹打2分钟； 5)将上述步骤所述含组织的1ml的199培养液移至15ml离心管中并静置I分钟； 6)移出上清至另一个干净的15ml离心管中，避免吸取底部的组织块； 7)将上述步骤获取的上清按1000RPM的速度离心5分钟，并弃去上清； 8)用1ml的Ham’sF-12培养液重悬步骤7)获得的细胞沉淀； 9)将上步骤获得的细胞移至培养皿或96孔板中，在37oC，9%C02的环境下培养； 10)显微镜观察所获得的细胞，并拍照； 11)分离第二天换液，之后每隔三天换一次培养液。2.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的新鲜的组织样品包括:未经中性福尔马林固定的手术切除组织和穿刺组织。3.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的组织样品前处理由特定的专业人员质控。4.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤8)的Ham’sF_12培养液中含5%FBS, I μ g/ml胰岛素和I μ g/ml氢化可的松。5.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的分离获得的细胞中含成纤维细胞少，肿瘤细胞含量高且呈半悬浮状态，培养一周后，其中90%以上为肿瘤细胞，且成克隆性生长。6.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的分离获得的乳腺癌原代肿瘤活细胞在用于乳腺癌药敏试验中的用途。
【专利摘要】本发明属于细胞分离技术领域，涉及高纯度批量乳腺癌原代肿瘤活细胞快速分离方法。本发明方法包括：获得离体的乳腺癌新鲜的组织样品，组织样品前处理和质控，高纯度批量乳腺癌原代肿瘤活细胞快速分离，批量快速分离高纯度乳腺癌原代肿瘤活细胞，本方法从乳腺癌组织块中分离活的乳腺癌细胞，肿瘤细胞纯度达90%以上。分离的乳腺癌原代肿瘤活细胞可用于药敏试验。本方法克服了现有技术原代乳腺癌细胞分离纯度低且极易受成纤维细胞污染等缺陷，能为临床药敏试验提供可靠的研究对象，为原代肿瘤细胞DNA、RNA和蛋白的建库以及为肿瘤在体研究提供新的方法和更广阔的材料来源。
【IPC分类】C12N5/09, C12Q1/02
【公开号】CN104974985
【申请号】CN201410146409
【发明人】朱虹光, 王漱阳, 陈琦, 王维
【申请人】复旦大学
【公开日】2015年10月14日
【申请日】2014年4月12日