多分化潜能细胞的制造方法
【技术领域】
[0001] 本发明广义地关于一种产生表现多分化潜能（multilineagepotential)细胞的 方法W及其所衍生的细胞，特别是，本发明为一种活体外（invitro)从CD14+单核细胞产 生哺乳动物干细胞的方法W及其所衍生的细胞。该发现目前已促使发明确实及有效地产生 多分化潜能细胞的方法，例如应用于各种临床上研究用途的干细胞，其中包含活体外或活 体内（invivo)的多分化潜能细胞的分化，某些病症经由给予本发明的多分化潜能细胞或 源自该些细胞更充分分化的细胞群体的治疗性或预防性治疗。亦促使W活体外为基础的筛 选系统的设计，该系统可用于测试细胞暴露于具潜力的疗程或培养策略时，该疗程或培养 策略的治疗性影响及/或其毒性。
【背景技术】
[0002] 在本说明书作者提及的公开详细书目细节在本文文末会依字母排列陈述。
[0003] 本说明参考的任何先前公开文献（或衍生的资讯），或任何已知的事项，非为及不 应视为承认或认可或任何形式的建议，其为该先前公开文献（或衍生的资讯）或已知的事 项构成在此领域中与本说明书有关的一般通常知识。
[0004] 本发明的相关目的在于鉴定、分离或产生哺乳动物干细胞及前驱细胞。"干细 胞"及"前驱细胞"通常应理解包含W各种含有能产生任何细胞型态（包含生殖细胞）的 全能分化性细胞（totipotentcell)W及能产生更受限制的各种成熟细胞体系的多功 能（pluripotent)前驱细胞两种。一些前驱细胞型态分化更完全且相当于能产生特定 细胞体系细胞的前驱细胞。该些能力是所有细胞分化及特化的基础，而细胞分化与特化 (specialization)的能力更是器官及组织完整发育所必要的能力。
[0005] 再现性（repro化cing) -词，在体外发展路径的选择方面，更着重于干细胞的分 离及培养。例如胚胎干细胞可经由培养源自囊胚内细胞团化lastocystinnercellmass) 的细胞及重复分离及继代培养而建立。在适当的条件下，活体外培养可维持该干细胞的正 常核型及全能分化性此两特性，此对于促进特定细胞体系的干细胞的分化已有重要的进 展。虽然胚胎干细胞巧巧已能从人类身上分离取得，但它们在研究及治疗的用途因伦理上 的考量而受到阻碍。
[0006] 成体组织亦含有能自我复制的干细胞群体，其子细胞能更进一步进行 不可逆的最终分化成为体细胞（Science, 287, 1442-1446, 2000)。最具特征性 的为造血干细胞及其子代，但在大部分组织中都能辨识到干细胞，包含间质、神 经元及造血细胞（Science, 284, 143-147, 1999Science,287, 1433-1438, 2000 ; J.H巧atol.，29, 676-682, 1998)。间质干细胞为骨髓中具分化为间质组织潜力的贴附型 的类纤维母细胞的细胞，包含硬骨、软骨、脂肪、肌肉及骨髓基质（Science, 284,143-147， 1999)。间质前驱细胞（mesenchymalprogenitors)在形态上及表型特征及分化潜力 上与间质干细胞相似，且该间质前驱细胞被报导极少出现在厮带血炬r.J.化ematol.， 109, 235-242, 2000)、胎儿炬lood, 98, 2396-2402, 2001)及成人周边血液（Arthritis Res.，2, 477-488, 2000)中。
[0007] 据此，分化总是被假设为经由很多基因的调节，干细胞采取线性发展的形式最后 达到最终分化的体细胞的表型，其功能清楚地被定义且其寿命是有限的。此种细胞的例子 包含红血球、破骨细胞、膜岛细胞及血小板。该干细胞被认为W分裂、自我更新及产生子细 胞来确保特定的细胞体系（不对称的分裂），其亦被认为在适当的环境条件下，干细胞能对 称地分裂W产生双倍的干细胞群。
[0008] 然而，实际上有效且确实的分离方法、细胞维持方法，还有特别是干细胞的增殖方 法仍然是难W捉摸的。因此，需要持续开发新的有效地且有再现性的分离、维持及分化干细 胞的方法。
[0009] 本发明已确认干细胞增殖不一定需要经由非对称干细胞分裂的发生，即可提供其 相关子细胞自特定细胞体系分化至最终成体细胞时的干细胞更新及体系分化等特性。相反 地，增殖可经由成熟细胞转变回具有多分化性潜能（multilineagepotential)的细胞的特 性而达成。该发现目前已促使确实及有效地产生表现多分化潜能细胞的方法的发展，而经 此宝贵机制转化而得的干细胞群体及/或体细胞分化而来的细胞将可用于临床及实验的 用途上。
【发明内容】
[0010] 本说明书全文及其后的权利要求，除非内容另有需要，该用词"包含（comprise)"， W及例如是"包含（comprises)"及"包含（comprising)"的其他变化形，将理解意指包含所 述整体或步骤或群体的整体或步骤，但不排除任何其他整体或步骤或群体的整体或步骤。
[0011] 本文所使用的，"源自（derived化om)"用语应代表W经由特定物种指定特定整体 或整体中的群体，但不一定直接从特定来源获得。再者，如本文中使用的单数形式的"一"、 "及及"该"包含多个指定对象，除非内容另有明确说明。
[0012] 除非有其他定义，本文使用的所有技术或科学用语与本发明所属技术领域中的通 常知识通常可理解具有相同意义。
[0013] 本发明一方面为一种产生哺乳动物多分化潜能细胞（multilineagepotential cells)的方法，该方法包含在活体外（invitro)建立细胞培养的比例包含：
[0014] (i) 15%v/v，或其功能上等同比例的CD14+单核细胞悬浮液；
[0015] (ii) 15%v/v，或其功能上等同比例的约5%至85%白蛋白溶液；W及
[0016] (iii)7〇%v/v，或其功能上等同比例的细胞培养基，
[0017] 其中该细胞培养维持在一时间及条件下，足W诱导该单核细胞转变为一表现多分 化潜能的细胞。
[0018] 另一方面提供一种产生哺乳动物多分化潜能细胞的方法，该方法包含在活体外 (invitro)建立细胞培养的比例包含；
[0019] (i) 15%v/v，或其功能上等同比例的CD14+单核球细胞悬浮液；
[0020] 扣）15%v/v，或其功能上等同比例的约5%至85%白蛋白溶液；W及
[0021] (iii)7〇%v/v，或其功能上等同比例的细胞培养基，
[0022] 其中该细胞培养维持在一时间及条件下，足W诱导该单核球细胞转变为一表现多 分化潜能的细胞。
[0023] 又另一方面提供一种产生哺乳动物多分化潜能细胞的方法，该方法包含在活体外 (invitro)建立细胞培养的比例包含；
[0024] (i) 15%v/v，或其功能上等同比例的源自周边血液的CD14+单核球悬浮液；
[002引 扣）15%v/v，或其功能上等同比例的约5%至85%白蛋白溶液；化及
[0026] (iii)7〇%v/v，或其功能上等同比例的细胞培养基，
[0027] 其中该细胞培养维持在一时间及条件下，足W诱导该单核球细胞转变为一表现多 分化潜能的细胞。
[0028] 此本发明尚有另一方面提供一种产生哺乳动物多分化潜能细胞的方法，该方法包 含在活体外（invitro)建立细胞培养的比例包含；
[0029] (i) 15%v/v，或其功能上等同比例的CD14+单核球细胞悬浮液；
[0030] (ii) 15%v/v，或其功能上等同比例的约5%至85%白蛋白溶液；化及
[0031] (iii)7〇%v/v，或其功能上等同比例的细胞培养基，
[0032] 其中该细胞培养维持在一时间及条件下，足W诱导该单核球细胞转变为一 表现多分化潜能的细胞，该多分化潜能细胞表现造血化aematopoietic)及/或间质 (mesenchymal)的潜能。
[0033] 还有另一方面提供一种产生人类多分化潜能细胞的方法，该方法包含在活体外 (invitro)建立细胞培养的比例包含；
[0034] (i) 15%v/v，或其功能上等同比例的人类周边血液CD14+单核球细胞悬浮液；
[003引 扣）15%v/v，或其功能上等同比例的约5%至85%白蛋白溶液；W及
[0036] (iii)7〇%v/v，或其功能上等同比例的细胞培养基，
[0037] 其中该细胞培养维持在一时间及条件下，足W诱导该单核球细胞转变为一表现多 分化潜能的细胞。
[003引仍有另一方面提供一种促使源自哺乳动物多分化潜能细胞 (mammalianMLPC-derivedcell)产生的方法，包含；
[0039] (i)活体外建立细胞培养的比例包含：
[0040] (a) 15%v/v，或其功能上等同比例的CD14+单核细胞悬浮液；
[0041] 化）15%v/v，或其功能上等同比例的约5%至85%白蛋白溶液；化及
[0042] (c)70%v/v，或其功能上等同比例的细胞培养基，
[0043] 其中该细胞培养维持在一时间及条件下，足W诱导该单核细胞转变为一表现多分 化潜能的细胞，且选择性地
[0044]m)将步骤（i)该表现多分化潜能细胞（MLPC)接触一刺激物W导向该多分化潜 能细胞分化为源自多分化潜能细胞（MLPC-derivedcell)的表现型。
[0045] 更有一方面提供一种促使源自哺乳动物多分化潜能细胞（Mammalian MLPC-derivedcell)产生的方法，包含；
[0046](i)活体外建立细胞培养的比例包含：
[0047] (a) 15%v/v，或其功能上等同比例的CD14+单核细胞悬浮液；
[004引 化）15%v/v，或其功能上等同比例的约5%至85%白蛋白溶液；化及
[0049] (c)70%v/v，或其功能上等同比例的细胞培养基，
[0050] 其中该细胞培养维持在一时间及条件下，足W诱导该单核细胞转变为一表现多分 化潜能的细胞，且选择性地
[0051] (ii)将步骤（i)该表现多分化潜能细胞（MLPC)接触一刺激物W导向该多分化潜 能细胞分化为造血或间质的表型。
[0052] 本发明另有进一步方面为一种治疗性及/或预防性治疗一哺乳动物病症的方法， 该方法包含给予该哺乳动物一有效数量的多分化潜能细胞（MLPC)或者部分或充分分化的 源自多分化潜能细胞的细胞（MLPC-derivedcell)，而该些细胞是依据本发明的方法产生 的。
[0053] 本发明进一步为一种治疗性及/或预防性治疗哺乳动物中造血或间质功能异常 为特征的病症的方法，该方法包含给予该哺乳动物：
[0054] (i) -有效数量的依据本发明的方法产生的造血干细胞或部分或充分分化的源自 造血干细胞的细胞；或
[0055] (ii) -有效数量的依据本发明的方法产生的间质干细胞或部分或充分分化的源 自间质干细胞的细胞。
[0056] 本发明的另一方面为MLPCs或源自MLPC的细胞的群体，该细胞依据本发明的方法 产生，用于制备治疗哺乳动物某病症的药物。
[0057] 本发明尚有另一方面为依据本发明的方法产生的MLPCs或源自MLPC的细胞。
[0058] 本发明再有另一方面提供一评估MLPC或源自MLPC的细胞在表型或功能状态上的 治疗或培养策略的效果的方法，该方法包含于该治疗策略中给予依据上述定义的方法产生 的MLPC或源自MLPC的细胞，并筛选出具有改变的功能或表型的状态。
【附图说明】
[005引图1为依据本发明的方法将细胞培养于37°C、C02培养箱1天的细胞样本的流式 细胞仪分析结果，在封闭式培养袋培养PBMCs，在第1天收集贴附的细胞。M2区域是表面标 记群体（surface marker population)染色结果的区域与同型配对对照（isotype-matched control antibody-FlTC)染色结果的区域的重迭图，其横轴表示蛋光信号强度。
[0060]图2为依据本发明的方法将细胞培养于37°C、C〇2培养箱3天的细胞样本的流式 细胞仪分析结果，在封闭式培养袋培养PBMCs，在第3天收集贴附的细胞。M2区域是表面标 记群体（surface marker population)染色结果的区域与同型配对对照（isotype-matched control antibody-FlTC)染色结果的区域的重迭图，其横轴表示蛋光信号强度。
[006。图3为依据本发明的方法将细胞培养于37°C、C02培养箱6天的细胞样本的流式 细胞仪分析结果，在封闭式培养袋培养PBMCs，在第6天收集贴附的细胞。M2区域是表面标 记群体（surface marker population)染色结果的区域与同型配对对照（isotype-matched control antibody-FlTC)染色结果的区域的重迭图，其横轴表示蛋光信号强度。
[006引图4为依据本发明的方法将细胞培养于37°C、C02培养箱7天的细胞样本的流式 细胞仪分析结果，在封闭式培养袋培养PBMCs，在第7天收集贴附的细胞。M2区域是表面标 记群体（surface marker population)染色结果的区域与同型配对对照（isotype-matched control antibody-FlTC)染色结果的区域的重迭图，其横轴表示蛋光信号强度。
[0063] 图5为利用显微镜观察依据本发明的方法于37°C、C〇2培养箱培养1天后的细胞 照片。细胞开始贴附及显示出楠圆形的型态。
[0064] 图6为利用显微镜观察依据本发明的方法于37°C、C〇2培养箱培养2天后的细胞 照片。细胞开始显示出类似纺键状及类似纤维母细胞的型态。
[0065] 图7为利用显微镜观察依据本发明的方法于37°C、C〇2培养箱培养3天后的细胞 照片。细胞显示出楠圆形及类似纺键状的型态。
[0066] 图8为利用显微镜观察依据本发明的方法于37°C、C〇2培养箱培养4天后的细胞 照片。
[0067] 图9为利用显微镜观察依据本发明的方法于37°C、C〇2培养箱培养4天后的细胞 照片。
[0068] 图10为利用显微镜观察依据本发明的方法于37°C、C〇2培养箱培养5天后的细胞 照片。
[0069] 图11为利用显微镜观察依据本发明的方法于37°C、C02培养箱培养6天后的细胞 照片。
[0070] 图12为CD14+PBMC流式细胞仪分析。
[0071] 图13为CD14+PBMC流式细胞仪分析的表格结果。
【具体实施方式】
[0072] 本发明推测为达到延自于特定体细胞体系干细胞自我更新（renewal)及分化两 者的目的，部分成体干细胞扩增是不一定基于不对称干细胞分裂的发生。特别是，多能干细 胞（multipotentstemcells)可源自于诱导较成熟的CD14+单核细胞转变为多分化潜能 (multilineagepotential)的阶段，经由适当的刺激下进行对称的分裂及分化。对本发明
技术领域而言该个发现是特别困难且有显着的重要性，因为在活体外（invitro)有效地诱 导干细胞自我更新或扩增的方法尚未