物质的Pyranine以及游离的共聚物。
[0127] 实施例7~10
[0128] 除了使用实施例2~5的共聚物以外，与实施例6同样地制得脂质体复合物。
[0129]实施例 11、12
[0130] 除了将EYPC与共聚物的重量比变为70:30以外，与上述实施例9、10同样地制得 脂质体复合物。
[0131] 对比例4~6
[0132] 除了使用对比例1~3的共聚物以外，与实施例6同样地制得脂质体复合物。
[0133] 对比例7
[0134] 除了不含共聚物以外，与上述实施例6同样地制得脂质体。
[0135] 脂质体复合物的温度、pH响应性评价
[0136] 评价了实施例6~10、对比例4~7的脂质体复合物对于温度、pH的响应性。
[0137] 脂质体的脂双层膜被破坏时，包含于脂质体内的Pyranine被释放到外水相。将被 释放的Pyranine通过下述方法用416nm的光进行激发，通过在512nm下测定所发出的焚 光，从而进行脂质体复合物的温度?pH响应性的评价。
[0138] 此外，由于在脂质体的脂双层膜中作为焚光物质的Pyranine、作为消光剂的DPX 的浓度都很高，激发的Pyranine与DPX的碰撞频率高，所以因激发的Pyranine立刻被DPX脱激发，故而焚光消失。由于当脂质体的脂双层膜被破坏，而Pyranine和DPX释放到 外水相时，被稀释而浓度下降，所以激发的Pyranine与消光剂的碰撞频率低从而维持荧 光。因此，用本发明的测定方法观测的荧光，可看做全部是源自从脂质体释放的外水相中的 Pyranine0
[0139] 将制备成各种pH的磷酸缓冲水溶液加入到石英池内，并置于分光荧光光度计内。 在各自的测定条件温度下保持温度约3分钟后，加入内包了Pyranine的脂质体复合物的 分散液以便分光荧光光度计中石英池内的脂质浓度成为〇. 〇2mM(终体积2. 5mL)。测定在 规定的温度下孵育10分钟时的Pyranine的释放量。最后加入25yLTritonX-100 (日本 KISHIDA化学制）10%溶液来破坏脂质体的脂双层膜。将在各温度下pH为7. 4时刚刚添加 脂质体复合物后的荧光强度（F^4)看做是0%的释放量，将加入10%TritonX-100后的 荧光强度（Fim,7.4)看做是100%的释放量，然后通过以下计算式计算脂质体复合物的内包 物的释放率。
[0140][数1]
[0141]
[0142] 此外，pH=X时的释放率Ft按照Ft=(测定値）XF1QQ,7.4/F1QQ,x，由补正为pH7. 4 的值计算。采用分光荧光光度计（日本分光株式会社制，装置名：FP-6200、FP-8500)及温 度调节器（日本分光株式会社制，装置名：ETC-272T)进行荧光强度的测定。
[0143] 实施例6~10、对比例5、7的在各温度下pH变化时的释放率图表如图4、5所示。 此外，对比例4、6的pH7. 4和5. 0时温度变化时的释放率图表如图6所示。
[0144] 首先，仅是未与共聚物复合化的脂质体的对比例7,即使pH发生变化也为保持内 包物的状态。此外即使温度升高释放量也无变化。因此，可确定脂质体自身没有温度?PH 响应性，而且即使温度、pH发生变化脂双层膜本身也不会被破坏。
[0145] 在使用本发明脂质体复合物的实施例6~10中，随着重复单元（b)的含有率的增 加，在PH6.0以下显著地促进了内包物的释放。这是由于随着重复单元（b)的增加共聚物 的疏水性增强，从而变得易于破坏脂双层膜。实施例7~10在作为恒温动物体温的33~ 43°C、作为细胞内消化器官的溶酶体内的pH值的pH5附近显示响应性，所以对于恒温动物 的处置特别优良。此外，实施例6也在较高温、较低pH下显示响应性，只要根据所需的响应 点来调节共聚物的摩尔比即可。
[0146] 重复单元（b)的含有率为0摩尔％、重复单元（c)的含有率为5摩尔％的对比例5 比对比例4、6、7的释放性优异，但与实施例对比时则差很多。推测由于对比例5具有重复 单元（c)，所以与脂质体形成复合物，但由于不具有重复单元（b)，所以共聚物的亲-疏水性 的相转移仅仅源自乙二醇结构的水合水。推测由于其疏水性仅在失去水合水的乙二醇结构 中弱，所以对比例5不能充分破坏脂双层膜从而释放率差。
[0147] 根据图6,对比例4、6即使在pH7. 4、pH5. 0的任一个中，在25~70°C的范围内也 无法看到内包物的释放，显示出与对比例7同等的结果。
[0148] 推测由于在对比例4、6中使用的共聚物不具有重复单元（c)，所以共聚物没有与 脂质体形成复合物，从而由于在通过凝胶过滤法进行纯化时，共聚物被除去，所以脂双层膜 未被破坏。
[0149] 将实施例9~12的在各温度下pH变化时的释放率图表如图7所示。
[0150] 由实施例9~12可确认在磷脂与共聚物的重量比为70:30、80:20时均具有良好 的Pyranine释放性。
[0151] 试验例3
[0152] 在细胞内的释放性实验
[0153] 实施例13
[0154] 将IOOmgEYPC溶解于IOmL氯仿。取ImL该溶液置于茄型烧瓶中，进而加入作为荧 光物质的DiIClS以便相对于总磷脂量成为0. 1摩尔％。通过旋转蒸发仪除去氯仿，从而在 烧瓶内壁面形成由EYPC和DiIC18构成的薄膜。
[0155] 加入实施例5的共聚物的甲醇溶液（2.Omg/mL)以便EYPC与共聚物的重量比成为 80:20,通过旋转蒸发仪除去甲醇，从而形成混合薄膜。通过将形成于烧瓶内壁面的混合薄 膜以附着在烧瓶内壁面的状态进行4小时真空干燥，从而完全除去溶剂。
[0156] 加入ImL作为焚光物质的f丐黄绿素（德国SigmaAldrich公司制）溶液（63mM， PH7. 4)，通过浴型超声波照射装置照射超声波，从而将混合薄膜从烧瓶内壁面剥离，然后将 混合薄膜分散于荧光液。用NaOH及HCl调整至pH7. 4。使该分散液在-20°C的乙醇浴中冰 冻，继而在25°C的水浴中融解，将该冰冻和溶解的操作进行5次，从而制得由混合薄膜构成 的脂质体分散液。
[0157] 将孔径为IOOnm的膜夹在挤压机上，通过使脂质体分散液透过25次，使脂质体的 粒径统一为l〇〇nm。其后，通过以55,OOOrpm进行120分钟离心处理除去上清液来进行纯 化。
[0158] 将源自人宫颈癌的细胞即HeLa细胞接种于松并玻底培养皿中以便成为每孔 2XIO5个，以DiffiM培养基作为培养液，在CO2培养箱内以CO2浓度5%、37°C培养过夜。
[0159] DMEM培养基的组成如下。
[0160] 9. 5mg/mL达尔伯克改良伊格尔培养基（DMEM，日本日水制药株式会社制）、0?Img/ mL苄青霉素钾、0.lmg/mL链霉素硫酸盐、20mM碳酸氢钠、4mML-谷氨酰胺、10%胎牛血清 (美国MPbiomedical，Inc公司制）。
[0161] 其后，用磷酸缓冲水溶液洗涤2次，用不含钙及镁的磷酸缓冲水溶液（以下，称为 PBS(-)。）洗涤1次，之后添加I.OmLDMEM培养基。
[0162] 通过加入脂质体复合物的分散液以便脂质浓度成为0. 75mM，加入PBS(-)以便总 量成为2mL，之后在37°C下孵育4小时，从而使脂质体进入细胞内。用磷酸缓冲水溶液洗涤 3次来除去未进入HeLa细胞内的脂质体。加入2mLDMEM，在培养箱内静置8小时。
[0163] 对比例8
[0164] 除了使用由上述对比例7制作的未与共聚物复合化的脂质体以外，与上述实施例 13同样地使不具有共聚物的脂质体进入HeLa细胞内。
[0165] 通过激光共聚焦显微镜进行细胞内动态的观察
[0166] 加入2mLDMEM(无酚红）通过激光共聚焦显微镜（CarlZeiss公司制，装置名：LSM 5EXCITER)，观察从脂质体分散液加入HeLa细胞中开始12小时后的细胞内动态。此外，DiIClS的荧光以红色进行观察，在脂双层膜中产生强的荧光，而在水相中该荧光较弱。由于 钙黄绿素以绿色荧光进行观察，超过IOmM浓度下自身消光，所以在脂质体内不发出荧光， 释放到外水相后才发出荧光。
[0167] 实施例13、对比例8的12小时孵育后的激光共聚焦显微镜图像分别如图8、9所 不。
[0168] 用实施例13的脂质体处理的细胞，显示出钙黄绿素的非常强的绿色荧光。此外， DiIC18的红色荧光较弱。
[0169] 实施例13中，脂质体通过胞吞作用进入细胞，并移动到核内体。由于移动到核内 体的脂质体复合物在37°C下具有高的pH响应性，所以对核内体内的弱酸性pH发生响应，进 而因脂双层膜被破坏，故而DiIClS的荧光较弱。此外，由于钙黄绿素被释放到脂质体外后 被外水相稀释，所以发出很强的钙黄绿素的荧光。
[0170] 此外，推测由于本发明的共聚物具有生物体适应性高的乙二醇结构，在表面附近 具有该共聚物的脂质体稳定性提高，抑制了由分解酶引起的分解，所以几乎不会发生因细 胞内的溶酶体导致的脂质体的分解。
[0171] 导入了对比例8的未与共聚物复合化的脂质体的HeLa细胞虽然比实施例13差但 也显示出绿色荧光。此外，观察到很多绿色和红色的显色在同一位置而引起的黄色的光点。
[0172] 由于对比例8的脂质体不具有共聚物，所以不显示由温度、pH而引起的响应性，但 钙黄绿素被释放到细胞内，从而显示绿色荧光。推测是归因于对比例8的溶酶体未与具有 乙二醇结构的共聚物复合化，所以易于被分解酶分解，使得脂质体自身被分解而释放内包 物。这也从以下角度被印证：对比例8的绿色荧光与实施例12相比为局部的，且绿色和红 色从同一位置发出而呈黄色。
[0173] 试验例4
[0174] 共聚物的合成2
[0175] 实施例14
[0176] 除将重复单元（a)变为78摩尔％、重复单元（c)变为2摩尔％以外，与上述试验 例1的实施例2同样地制得共聚物。
[0177] 试验例5
[0178] 脂质体复合物的制作2
[0179] 实施例15
[0180] 将非