氢化蛋黄磷脂酰胆碱的氯仿溶液变为使20mg非氢化大豆磷脂酰胆碱（德国 Lipoid公司制，商品名：Phospholipon90G，以下称为SoybeanPC。）溶解于3mL氯仿和甲 醇的混合溶剂（体积比2:1)的液体；作为发色溶液使用溶解了 63mM钙黄绿素的0.Olmol/ L浓度的PBS(-) (pH7. 4)溶液，并将非氢化大豆磷脂酰胆碱与共聚物的重量比变为90:10 ; 将由凝胶过滤进行纯化所使用的凝胶变为ShepadexG_50(德国SigmaArdrich公司制）； 除上述以外，与上述试验例2的实施例7同样地制得脂质体复合物。
[0181] 实施例16
[0182] 除了使用由实施例14制得的共聚物以外，与上述实施例15同样地制得脂质体复 合物。
[0183] 对比例9
[0184] 除了使用由对比例3制得的共聚物以外，与上述实施例15同样地制得脂质体复合 物。
[0185] 脂质体复合物的温度、pH响应性评价
[0186] 使实施例15、16、对比例9的脂质体复合物的温度、pH发生变化。
[0187] 当脂质体的脂双层膜被破坏时，脂质体内所含的钙黄绿素被释放到外水相。通过 将被释放的钙黄绿素用下述方法由490nm的光进行激发，并在520nm处测定所发出的荧光， 从而进行脂质体复合物的温度?pH响应性评价。
[0188] 此外，如上述试验例3中所述，由于钙黄绿素在超过IOmM的浓度下自身消光，所以 在脂质体内不发出荧光。
[0189] ?温度响应性评价
[0190] 将制备成pH7. 4的磷酸缓冲水溶液加入到试管中。添加脂质体溶液以便试管内的 脂质浓度成为〇. 〇2mM(终体积4mL)。测定是以25~70°C的范围常规升温。孵育10分钟 后，加入1 %NaOH水溶液以便成为pH7. 4,之后测定钙黄绿素的释放量（因为钙黄绿素在弱 酸性条件下消光）。最后加入80yL10%TritonX-100来破坏脂质体。将在各温度下pH 为7. 4时的脂质体刚刚添加到缓冲液后的荧光强度看做是0% (匕,7.4)的释放量、将添加了 10%TritonX-100时的焚光强度看做是100%的释放量（Fltw,7.4)，从而通过以下计算式计 算脂质体的内包物的释放率。
[0191] [数 2]
[0192]
[0193] 使用SPECTRAMAXGEMINIEM(日本MorecularDeviceJapan公司制）进行荧光 强度的测定。
[0194] ?pH响应性评价
[0195] 将制备成各pH的磷酸缓冲水溶液加入到试管中。添加脂质体溶液以便试管内的 脂质浓度成为〇. 〇2mM后，在35°C下孵育30分钟（终体积4mL)。其后，加入1 %NaOH水溶 液以便成为PH7. 4。其后，测定钙黄绿素的释放量。最后加入80yL10%TritonX-100以 破坏脂质体。其后，与上述温度响应性同样地计算脂质体的释放率。
[0196] 实施例15、16、对比例9在pH7. 4时的各温度下的释放率如图10所示，在温度35 度时的各pH下的释放率如图11所示。
[0197] 实施例15、16在特定的温度、pH下良好地释放了内包物。在pH7. 4的中性中显示 了大体相同的表现，但在温度35度中，具有5摩尔％重复单元（c)的实施例15比具有2摩 尔％重复单元（c)的实施例16释放率高。推测这是由于含有重复单元（c)越多则共聚物 与脂质体越易于形成复合物。另外，实施例15与使用了相同的共聚物的复合物即试验例2 的实施例7相比，释放率升高，认为这是由于形成脂质体的磷脂不同、荧光物质不同等。
[0198] 使用了不具有重复单元（C)的共聚物的脂质体复合物即对比例9,不显示对温度、 PH的变化的响应。推测这是由于不具有重复单元（C)的共聚物难以与脂质体形成复合物， 且在生成过程中共聚物被消除。
[0199] 试验例6
[0200] 脂质体复合物的制作3
[0201] 实施例17~20
[0202] 除了分别使用由实施例1~4制得的共聚物，且非氢化大豆磷脂酰胆碱与共聚物 的重量比变为90:10以外，与上述实施例15同样地制得脂质体复合物。
[0203] 对比例10
[0204] 除了使用由对比例2制得的共聚物以外，与上述实施例15同样地制得脂质体复合 物。
[0205] 与上述试验例5同样地评价脂质体复合物的温度、pH响应性。
[0206] 在pH5. 0时的各温度下的释放率如图12所示，温度35度时的各pH下的释放率如 图13所示。
[0207] 使用了本发明的脂质体复合物的实施例17~20均对温度、pH变化显示出良好的 响应。确认了也许是由于重复单元（b)少，由羧基的质子化而产生的疏水化弱，所以与重复 单元（b)为10摩尔％的共聚物复合化的实施例17和与重复单元（b)分别为20摩尔％、 30摩尔％的共聚物复合化的实施例18、19相比存在释放率差的条件，确认了随着重复单元 (b)的含有率的增加，响应点向高温、低pH移动的趋势。显示出通过共聚物的摩尔比可调节 响应点。
[0208] 与重复单元（b)的含有率为0摩尔％的共聚物复合化的对比例10几乎没有释放 内包物。虽然在35°C的强酸下，看到了稍许漏出，但是由于对比例10中使用的共聚物没有 具有pH响应性的羧基，所以该原因不明。
[0209] 试验例7
[0210] 含有氢化磷脂的脂质体复合物的制作
[0211] 实施例21
[0212] 将SoybeanPC的分子量假定为二油酰磷脂酰胆碱的分子量即786. 1，除了将 SoybeanPC变为90摩尔％SoyBeanPC与10摩尔％分子量734. 04的氢化磷脂（日本日油 株式会社制，商品名：C0ATS0MEMC-6060,以下称为DPPC。）的混合物以外，与实施例20同 样地制得含有氢化磷脂的脂质体复合物。
[0213] 与上述试验例5同样地评价含有氢化磷脂的脂质体复合物的温度响应性。
[0214] 评价结果与由上述实施例20制得的脂质体复合物均如图14所示。
[0215] 与实施例20、21同样地在pH7. 4中不显示温度响应性，而在pH5. 0中则显示良好 的温度响应性。含有氢化磷脂的实施例21与仅由非氢化磷脂构成的实施例20相比，在低 温下的释放率被抑制得较低。推测这是由于通过含有氢化磷脂使脂双层膜变得更致密，内 包物的漏出变得更少。
[0216] 试验例8
[0217] 含有植物留醇的脂质体复合物
[0218] 实施例22
[0219]除了将SoybeanPC变为SoybeanPC与将分子量假定为P-谷甾醇的分子量即 414. 7的植物留醇S(日本TAMA生物化学株式会社制）的摩尔比为80:20的混合物以外，与 实施例20同样地制得含有植物留醇的脂质体复合物。
[0220] 与上述试验例5同样地评价含有植物留醇的脂质体复合物的温度响应性。
[0221] 评价结果与由上述实施例20制得的脂质体复合物均如图15所示。
[0222] 实施例22也与实施例20、21同样在pH7. 4中不显示温度响应性，而在pH5. 0中显 示良好的温度响应性。此外，含有植物留醇的实施例22与仅由非氢化磷脂构成的实施例20 相比，在低温下的释放率被抑制得较低。推测这是由于通过含有植物留醇，由非氢化磷脂构 成的脂双层膜的膜流动性、膜透过性降低。
【主权项】
1. 一种共聚物，其特征在于，具有来自下述通式（1)表示的单体的重复单元（a)、来自 含簇基的单体的重复单元化）、来自下述通式（2)表示的单体的重复单元（C)，式（1)中，Ri表示氨原子或甲基，R2表示碳原子数为1~4的烷基，n表示1~4的自 然数，式（2)中，R3表示氨原子或甲基，R4表示碳原子数为8~20的烷基或碳原子数为8~ 20的链締基，m表示1~6的自然数。2. 根据权利要求1所述的共聚物，其特征在于，相对于重复单元（a)~（C)的合计100 摩尔％，重复单元（a)为40~89摩尔％，重复单元化）为10~50摩尔％，重复单元（C) 为1~10摩尔％。3. 根据权利要求1或2所述的共聚物，其特征在于，所述含簇基的单体为甲基丙締酸。4. 根据权利要求1~3中任一项所述的共聚物，其特征在于，重均分子量为1，000~ 1,000, 000。5. -种脂质体复合物，其特征在于，权利要求1~4中任一项所述的共聚物负载于脂质 体的脂双层膜。6. 根据权利要求5所述的脂质体复合物，其特征在于，所述脂双层膜与所述共聚物的 重量比为50:50~99:1。7. 根据权利要求5或6所述的脂质体复合物，其特征在于，所述脂双层膜含有氨化憐 脂。8. 根据权利要求5~7中任一项所述的脂质体复合物，其特征在于，所述脂双层膜含有 酱醇。9. 根据权利要求5~8中任一项所述的脂质体复合物，其特征在于，在内部包含药效成 分。10. -种皮肤外用剂、化妆料、食品、医药品或生化试剂，其特征在于，含有权利要求 1~4中任一项所述的共聚物和脂质体。
【专利摘要】本发明提供一种在特定的温度、pH下引起亲-疏水变化的共聚物，以及通过与该共聚物复合化，可在特定温度、pH下释放内包物的脂质体复合物。其为具有来自下述通式(1)表示的单体的重复单元(a)、来自含羧基的单体的重复单元(b)、来自下述通式(2)表示的单体的重复单元(c)的共聚物，以及与该共聚物复合化的脂质体复合物。(式(1)中，R1表示氢原子或甲基，R2表示碳原子数为1～4的烷基，n表示1～4的自然数)。(式(2)中，R3表示氢原子或甲基，R4表示碳原子数为8～20的烷基或碳原子数为8～20的链烯基，m表示1～6的自然数)。
【IPC分类】A61K8/14, A61K47/32, A61K8/81, A61K9/127, C08F220/28, C08F220/06
【公开号】CN105001370
【申请号】CN201510192460
【发明人】山崎奈穗子, 粂井贵行, 河野健司, 小宫博之
【申请人】株式会社芳珂, 公立大学法人大阪府立大学, 日油株式会社
【公开日】2015年10月28日
【申请日】2015年4月22日