达 都有明显的降低，而单核细胞表面标识分子CD14则有一定程度的增高。
[0132] 上述结果表明=Inc-DC能够促进从单核细胞到树突状细胞的分化成熟。
[0133] 实施例5 :DC细朐分泌IL-12的功能检测
[0134] 如同实施例1和3中所述，在单核细胞分化为DC的过程中，用包装好的Inc-DC RNAi慢载体及其对照载体（Control RNAi)感染细胞（MOI=IOO)。在第七天DC成熟后，收 集细胞培养上清，采用ELISA (R&D公司）检测人IL-12p70,具体步骤参照ELISA试剂盒说明 书。
[0135] 与上述实验同步进行如下实验：在LPS刺激后的0小时（Oh)、12小时（12h)、24小 时（24h)，收集细胞，用TRIzol (Invitrogen公司）提取RNA。对所得RNA进行反转录，然后 进行 qRT-PCR。
[0136] 反转录使用的是高速逆转录试剂盒（Τ0Υ0Β0公司，First Strand cDNA Synthesis Kit，Code No. FSK-100)。反转录反应参数：42°C 20 分钟，99°C 5 分钟，4°C 10 分钟。
[0137] 反转录后qRT-PCR定量检测IL-12A mRNA的表达量，使用的是SYBR RT-PCR 试剂盒（Takara 公司，SYBR Green Realtime PCR Master Mix Code :QPK_201)，并在 LightCycler (Roche公司）实时定量PCR仪上进行操作。
[0138] IL-12A qRT-PCR检测用的定量引物为：
[0139] 5,-CCT TGC ACT TCT GAA GAG ATT GA-3,（上游，SEQ ID NO: 14);
[0140] 5, -ACA GGG CCA TCA TAA AAG AGG T-3,（下游，SEQ ID NO: 15)。
[0141] qRT-PCR 反应参数：95°C 15 秒，57°C 10 秒，68°C 2 秒读板，72°C 30 秒，40 循环。
[0142] RNA的相对定量使用2- Λ Λ Ct法计算（GAPDH为内参）。
[0143] GAPDH qRT-PCR检测用的定量引物为：
[0144] 5,-TGT GGG CAT CAA TGG ATT TGG-3,（上游，SEQ ID NO:9);
[0145] 5'-ACA CCA TGT ATT CCG GGT CAA T-3'（下游，SEQ ID NO: 10)
[0146] 实验结果如图5和图6所示。该结果显示：lnc_DC干扰后DC分泌IL-12的能力 明显下降。
[0147] 由于分泌IL-12是DC成熟后功能的一个显著特征，而IL-12能够调控免疫细胞功 能，发挥后续激活免疫应答的作用，因此上述结果表明Inc-DC能够促进人DC细胞的成熟和 功能。
[0148] 实施例6 :DC细朐活化同种异体⑶4寸细朐功能的检测
[0149] 用磁珠分选法抗-⑶4微珠（Miltenyi Biotech公司）从人外周血单核细胞PBMC 中分选CD4+T细胞。在同种异体DC和T细胞共培养实验中，在96孔板的每孔中加入T细胞 (I X IO5个），然后按照10:1或50:1 (T细胞：DC)的比例加入同种异体的经过相应处理（即 诱导成熟+转染）的DC细胞（第7天，如实施例1和3)。共培养5天后用CountBright? absolute counting beads (Invitrogen公司）流式检测T细胞数量，从而反映T细胞的增 殖情况（图7);上清用ELISA检测细胞因子IFN-γ和IL-2的分泌情况（R&D公司），从而 反映T细胞的活化情况（图8)。
[0150] 实验结果如图7和图8所示。结果显示：lnc-DC干扰后DC活化T细胞的能力明显 减弱，表现为CD4 +T细胞的增殖下降和CD4+T细胞分泌细胞因子的能力下降。该结果表明： Inc-DC对于DC活化T细胞的能力而言是必需的，Inc-DC能够促进人DC活化同种异体T细 胞的能力。
[0151] 综h.所沭，实施例3-6中所得的结果表明，Inc-DC对干人树突状细朐的if常分化 和功能是必需的，对其讲行干扰抑制后能够实现对DC成孰和功能的调控，以及对DC相关免 疫应答的调控。因此，Inc-DC可应用干免疫相关的干预治疗或诊断预后检测，同时可应用 干DC疫苗的制各。
[0152] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独 引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范 围。
【主权项】
1. 选自下组的序列或其表达产物、或其抑制剂或促效剂在调节常规树突状细胞的成熟 状态和/或功能中的应用： (a) SEQ ID NO: 1 或 SEQ ID NO: 2 所示的序列； (b) 在严格条件下与（a)限定的序列杂交的序列； (c) 与（a)或（b)中序列具有90%以上序列相同性的序列；和 (d) (a)或（b)中序列在非人哺乳动物中的同源序列。2. 选自下组的序列或其表达产物、或其抑制剂或促效剂在制备调节常规树突状细胞的 成熟状态和/或功能的药物或试剂盒中的应用： (a) SEQ ID NO: 1 或 SEQ ID NO: 2 所示的序列； (b) 在严格条件下与（a)限定的序列杂交的序列； (c) 与（a)或（b)中序列具有90%以上序列相同性的序列；和 (d) (a)或（b)中序列在非人哺乳动物中的同源序列。3. 如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述序列是SEQ ID N0:1或SEQ ID N0:2 所示的序列或SEQ ID NO: 16所示的同源序列。4. 如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述成熟状态选自：细胞表面共刺激分 子的表达⑶80/86、⑶40,抗原递呈分子HLA的表达，免疫活化细胞因子IL-12的产生；所述 功能选自：激活初始T细胞应答、启动免疫应答、调控免疫应答、维持免疫应答、摄取抗原、 加工处理抗原和递呈抗原。5. 如权利要求1或2所述的应用，其特征在于， 所述序列或其表达产物、或其促效剂促进常规树突状细胞的成熟和/或促进其功能， 优选与未接触所述序列或其表达产物、或其促效剂的对照树突状细胞或前体细胞相比，增 加成熟树突状细胞表面表达的功能分子（如抗原递呈分子HLA-DR、共刺激分子CD80和 ⑶40)、提高IL-12分泌、使树突状细胞活化⑶4 +T细胞的能力提高（如T细胞分泌的IFN-Y 和IL-2增加）、和/或使树突状细胞促进T细胞增殖的能力提高； 所述序列或其表达产物的抑制剂阻碍常规树突状细胞的成熟和/或阻碍其功能，优选 与未接触所述抑制剂的对照树突状细胞或前体细胞相比，减少成熟树突状细胞表面表达的 功能分子（如抗原递呈分子HLA-DR、共刺激分子⑶80和⑶40)、降低IL-12分泌、使树突状 细胞活化CD4 +T细胞的能力降低（如T细胞分泌的IFN- Y和IL-2减少）、和/或使树突状 细胞促进T细胞增殖的能力降低。6. 如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述促效剂选自：包含所述序列的表达 载体、所述序列的外源性表达产物、促使所述序列高表达的试剂；所述序列或其表达产物的 抑制剂选自：针对所述序列的RNAi、反义寡核苷酸、用于阻遏或降低所述序列表达的特异 性抑制剂或阻碍其功能的分子化合物等试剂。7. 如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述序列或其表达产物、或其抑制剂或 促效剂进一步用于对机体免疫应答的调控、防治免疫相关疾病、免疫治疗方案选择和/或 预后评估。8. -种药物或试剂盒，其包含： i)有效量的选自下组的序列或其表达产物、或其抑制剂或促效剂： (a) SEQ ID NO: 1 或 SEQ ID NO: 2 所示的序列； (b) 在严格条件下与（a)限定的序列杂交的序列； (c) 与（a)或（b)中序列具有90%以上序列相同性的序列；和 (d) (a)或（b)中序列在非人哺乳动物中的同源序列； ii)药学或免疫学上可结合的载体或辅料。9. 一种调节常规树突状细胞的成熟状态和/或功能的方法、或诱导产生所需成熟状态 和/或功能的常规树突状细胞或的方法，所述方法包括使选自下组的序列或其表达产物、 或其抑制剂或促效剂接触常规树突状细胞和/或其前体细胞的步骤： (a) SEQ ID NO: 1 或 SEQ ID NO: 2 所示的序列； (b) 在严格条件下与（a)限定的序列杂交的序列； (c) 与（a)或（b)中序列具有90%以上序列相同性的序列；和 (d) (a)或（b)中序列在非人哺乳动物中的同源序列。10. 如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法还包括： 在所述接触步骤之前、之时或之后，使所述常规树突状细胞和/或其前体细胞与树突 状细胞致敏剂接触，优选所述致敏剂为肿瘤抗原。
【专利摘要】本发明提供了一种长链非编码RNA、其序列及用途。具体而言，本发明涉及SEQ？ID？NO:1或SEQ？ID？NO:2所示的序列(即lnc-DC)或其杂交或同源序列或其表达产物、或其抑制剂或促效剂在调节常规树突状细胞的成熟状态和/或功能中的应用或在制备调节常规树突状细胞的成熟状态和/或功能的药物或试剂盒中的应用，以及相应的试剂盒和方法。本发明可应用于调节常规树突状细胞的成熟状态和/或功能，和/或进一步用于对机体免疫应答的调控、防治免疫相关疾病、免疫治疗方案选择和/或预后评估，具有广泛的应用前景。
【IPC分类】A61K48/00, A61K45/00, C12N5/0784
【公开号】CN105018426
【申请号】CN201410155433
【发明人】曹雪涛, 王品
【申请人】中国人民解放军第二军医大学
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2014年4月17日