于35mm培养皿内，培养皿内盛有600 y 1完全培养基（含20%FBS、0. 5%。抗坏血酸的M199培养基），终止消化、保证血管湿润以防止切块后组织的黏附。消化后组织块呈伸展状态，用刀片横切为0. 5mm的组织小块，并用10ml注射器针头挑取组织小块，将其均匀平铺于含有600 y 1完全培养基（含20% FBS、
0.5%。抗坏血酸的M199培养基）的35mm细胞培养皿内，保持组织块的间距为1mm左右，铺板完成后在37°C 5% C02中原代培养，铺板后1天内不移动培养皿。
[0031]原代培养第3天观察细胞爬出情况，并向培养皿内补液200 y 1，注意不要冲击组织小块，以防组织块脱落。原代培养第4天用针头小心挑出组织小块后吸出培养基，用移液枪吸取1ml完全培养基（含20% FBS、0. 5%。抗坏血酸的M199培养基）沿培养皿加入，继续原代培养。
[0032]原代培养第5天，细胞长至对数期，进行传代培养，吸出培养基，用25°C的PBS洗涤2次，向35mm细胞培养皿内均匀加入200 y 1 0. 08%胰蛋白酶溶液（0. 25% PBS稀释，无EDTA)，置于37°C环境消化4min，观察到细胞变圆、回缩，吸出消化液后加入1ml传代完全培养基（含10% FBS、0. 5%。抗坏血酸的M199培养基），小心吸取培养基对着爬出的细胞堆吹打，形成细胞悬液，置于50ml离心管内，培养箱内保存，待所有培养皿内细胞消化完成后，倒置显微镜下观察细胞悬液密度，调节细胞密度至2. 0X105个/ml，吸取5ml细胞悬液接种至90_细胞培养皿内，贴着超净台前后左右晃动培养皿，使得细胞均匀铺板于培养皿内，37°C 5% C02培养。观察培养基颜色，待培养基颜色由红色变为桔黄色时换液（一般为2天），继续培养。当细胞生长融合至90%左右后，即可进行后续传代培养。
[0033](2)培养结果
[0034]倒置显微镜下观察，铺板第3天组织小块周围有细胞爬出（见图2)，组织块周围细胞重叠堆积生长形成“峰”，在“峰”与“峰”间的细胞较少而呈“谷”状，因而在组织块周围形成“峰” “谷”状的典型特征（见图3)。
[0035]倒置显微镜下观察平滑肌a -actin抗原的免疫荧光和HocheSt33342的核染荧光，传代细胞生长旺盛，传代后1天即可贴壁，细胞伸展呈梭形、三角形、星形等多种形态，且具有平滑肌典型的“峰” “谷”状。
[0036]焚光显微镜下，Cy3标记的平滑肌a-actin抗原发红色焚光，Hochest33342标记的细胞核法蓝色荧光。高倍镜（40X10)下观察，平滑肌细胞胞浆中的肌丝平行于细胞长轴呈细丝状表达。阴性对照未加一抗，仅检测到Hochest33342标记的细胞核蓝色荧光，未见Cy3标记的红色荧光。低倍镜（4X10)下观察计算细胞纯度，每张片子取5个视野，每个视野至少检测200个细胞。计算每个视野中a-actin表达阳性细胞占该视野总细胞数的比例，计算平滑肌细胞的纯度为99%。
[0037]实施例2
[0038]采用与实施例1相同方法进行鸡胚肺动脉平滑肌细胞的分离培养，区别仅在于，原代培养过程中所使用的传代完全培养基为含有20% FBS的M199培养基。观察并计算平滑肌细胞纯度为89 %。
[0039]实施例3
[0040]采用与实施例1相同方法进行鸡胚肺动脉平滑肌细胞的分离培养，区别仅在于，传代培养过程中所使用的传代完全培养基为含有10% FBS的M199培养基。观察并计算平滑肌细胞纯度为92%。
[0041]对比例1
[0042]本对比例用于说明现有技术对鸡胚肺动脉平滑肌细胞进行分离培养的方法。
[0043]按照文献《鸡肺动脉平滑肌细胞培养及免疫组化鉴定》中公开的方法进行鸡胚肺动脉平滑肌细胞的分离培养，观察并计算平滑肌细胞纯度为95 %。
[0044]对比例2
[0045]本对比例用于说明现有技术对鸡胚肺动脉平滑肌细胞进行分离培养的方法。
[0046]按照《低氧条件下鸡胚肺动脉内皮细胞内皮素-1的分泌及其对中膜平滑肌细胞的影响》中公开的方法进行鸡胚肺动脉平滑肌细胞的分离培养，观察并计算平滑肌细胞纯度为95%。
[0047]虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1.一种鸡胚肺动脉平滑肌细胞的分离培养方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤: 分离鸡胚人字形肺动脉血管并用PBS保证其湿润，修剪去除血管周围细小的结缔组织，将人字形血管分离为两根血管后分别对两根血管进行两次纵切，用胰蛋白酶溶液将纵切后的血管在37°C消化l_2min后用完全培养基终止消化获得消化后的组织块，将消化后的组织块切割成尺寸为0.4-0.6mm的组织小块，将组织小块在完全培养基中进行原代培养。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将组织小块在完全培养基中原代培养的条件包括，按照0.8-1.2mm间距将组织小块平铺在含有完全培养基的培养皿内进行原代培养。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在原代培养第3天进行补液；以及，在原代培养第4天挑出培养皿内的组织块并更换培养皿中的完全培养基继续原代培养。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在原代培养第5天进行传代培养，所述传代培养的条件包括:用浓度为0.08-0.085%的胰蛋白酶溶液在37°C下消化3-5分钟后添加传代完全培养基终止消化，调整细胞悬液的密度至2.0X 15个/ml后接种于培养皿中。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，原代培养中所使用的完全培养基为含有20% FBS和0.5%。抗坏血酸的M199培养基；传代培养中所使用的传代完全培养基为含有10% FBS和0.5%。抗坏血酸的M199培养基。6.根据权利要求1-5中任意一项所述的方法，其特征在于，用于消化纵切后的血管的胰蛋白酶溶液的浓度为0.25%。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，分离鸡胚人字形肺动脉血管的步骤包括: 将经过75%酒精喷洒消毒的鸡胚放置于超净台内，取用第一套镊子敲击鸡胚钝端气室，镊子小心卡住鸡胚颈部取出鸡胚，用第一套剪刀剪断鸡胚未吸收部分；取用第二套剪刀镊子剪开鸡胚胸腔，防止羽毛黏附于内脏，擦拭剪刀镊子；用第三套镊子夹住心尖，向上提起露出心脏腹面，剪刀小心剥离白色血管周围的结缔组织，并斜向下方向沿着血管根部剪断，保证人字形肺动脉血管的长度，取下放置于盛有PBS的培养皿内。8.根据权利要求1-5和7中任意一项所述的方法，其特征在于，所述鸡胚的胚龄为16-17 天。
【专利摘要】本发明涉及一种鸡胚肺动脉平滑肌细胞的分离培养方法，所述方法包括以下步骤：分离鸡胚人字形肺动脉血管并用PBS保证其湿润，修剪去除血管周围细小的结缔组织，将人字形血管分离为两根血管后分别对两根血管进行一次纵切，用胰蛋白酶溶液将纵切后的血管在15-37℃消化1-2min后用完全培养基终止消化获得消化后的组织块，将消化后的组织块切割成尺寸为0.4-0.6mm的组织小块，将组织小块在完全培养基中进行原代培养。操作简单，重复性好，培养的细胞纯度高，生长周期短，培养第3天即可见细胞爬出，原代培养4天后即可进行传代培养，细胞生长旺盛。
【IPC分类】C12N5/073, C12N5/077
【公开号】CN105039243
【申请号】CN201510438166
【发明人】杨鹰, 张明, 张华 , 蔡虹
【申请人】中国农业大学
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年7月23日