一种促进Ru(II)金属络合物细胞核摄取的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种促进Ru(II)金属络合物细胞核摄取的 方法。
【背景技术】
[0002] DNA是遗传信息的载体，因此了解DNA在细胞核内的组装和结构具有非常重要的 意义。目前，利用荧光显微镜，使用能够与DNA结合的细胞膜通透性良好的有机荧光分子作 为DNA标记探针是实现这一目标的主要手段。但是，现有的许多荧光染料存在水溶性低，毒 性强及光漂白等的缺点。因此，探索新的生物显像试剂似乎显得尤为重要，而过渡金属络 合物为此提供了广阔的应用前景。1990年，Barton和Sauvage研究组报道联吡啶并吩嗪 (dppz)金属配体络合物与DNA有着很强的亲和力（结合常数Kb~106M3。有趣的是，这 些络合物与DNA结合后会发出强烈的MLCT荧光（MLCT指金属到配体的电荷转移），而未与 DNA结合的络合物则没有荧光现象。这一现象被认为是DNA的"光开关效应"，已经被广泛 用于研究多种金属多吡啶络合物与DNA之间的相互作用。由于这种"光开关"现象可通过 荧光显微镜观察并检测，因此这类金属络合物在细胞显像的应用中可能具有广阔的应用前 景，其中又以d6过渡金属络合物最为显著，这是因为此类络合物具有一系列吸引人的光学 显像特性，包括：良好的水溶性、较强的光稳定性、可见光区低MLCT激发能（避免UV损伤作 用）、发光寿命长、相对高的Stokes位移（一般大于100nm)。此外，这类络合物除自身具有 上述丰富的特性外，其配体的三维空间结构还能使络合物成功地与DNA结合；配体结构的 细微修饰能导致络合物与DNA的键合模式、键合位置、键合强度和光物理特性发生微弱或 明显的变化，因此可以通过改变配体来调控络合物的细胞摄取状况，以及调节分子疏水性、 亲和力及选择性。这为筛选寻找具有不同功能的DNA结构探针提供了良好的方法。
[0003] 近年来，有关金属络合物探针的研究主要集中于化学体系，而用于活细胞内DNA 直接显像的成功的实例却较为少见。大量研究结果表明限制金属络合物在活细胞中显像应 用的主要因素是由于它们较低的膜通透性，而DNA作为胞内的主要作用靶点，金属络合物 若要与活细胞内的DNA相互作用，则分子不仅要进入细胞内，而且还要进入到细胞核（或线 粒体）内。例如，典型的金属舒嵌入剂[Ru(bpy)2(dppz)]2+和[Ru(phen) 2(dppz)]2+络合物， 因具有较弱的脂溶性而不能透过细胞膜进入细胞内。尽管如此，上述两种络合物都可用于 固定细胞条件下的DNA染色或用于区别活细胞显像中的死细胞。但是，如果这些金属络合 物能够用于活细胞内的DNA染色，这将具有更重要的生物学意义。
[0004] 为实现上述活细胞内DNA染色的目的，应增强金属络合物的细胞摄取水平。基于 此，人们开始采取多种方法对金属络合物进行改造，如：通过增强络合物的疏水性-即引入 疏水配体如苯环或烷基链，使得其在本质上与脂质更类似，从而改变其通过细胞膜的能力。 然而，在改变络合物疏水性能从而调控细胞摄取的同时，也可能会影响该络合物的细胞定 位，且通常会使其与细胞核结合的靶向性降低。此外，采用共价结合荧光分子如荧光素或 罗丹明是研究生物活性分子在细胞内分布的一种普遍方法，而这同样也可用于金属络合物 研究。Puckett等的研究表明，标记了荧光素的Ru(dppz)络合物可直接进入细胞核，而未 标记的则不能进入。尽管荧光素的荧光发射明确定位出该络合物定位于细胞核，但却不能 观察到分子中钌组分自身产生的核内MLCT荧光。这很可能意味着，这些荧光分子改变了 Ru(dppz)络合物自身的发光特性。
[0005] 综上所述，无论是通过增加络合物疏水性的方法还是将金属络合物进行荧光素标 记，都不仅需要消耗大量的时间和精力来设计合成，而且所合成的络合物的光物理性能也 可能发生改变，使它们不能进入到细胞核或是改变母体络合物产生荧光的特性。因此，一种 简单且行之有效的可促进Ru(II)络合物在活细胞内摄取的方法就显得尤为重要。
【发明内容】
[0006] 本发明的一个目的是提供一种促进Ru(II)金属络合物细胞核摄取的方法。
[0007] 本发明提供的促进Ru(II)金属络合物细胞核摄取的方法包括如下步骤：在含 有阳离子Ru(II)金属络合物和生物化学试剂的培养体系中培养细胞，实现所述阳离子 Ru(II)金属络合物进入活细胞的细胞核；
[0008] 所述生物化学试剂为卤代酚类、羰基氰类或非留体类抗炎药。
[0009] 上述方法中，所述阳离子Ru(II)金属络合物与所述生物化学试剂的物质的摩尔 比为（1-5) : 3 ;
[0010] 所述阳离子Ru(II)金属络合物为式I所示的[Ru(bpy) 2dppz]2+、式II所示 的[Ru(phen)2dppz]2+、式 III所示的[Ru(DIP)2dppz]2+或式 IV所示的[Ru(bpy)2tpphz Ru(bpy) 2]4+；
[0011]
[0012]
[0013] 所述卤代酚类为五氯酚、2, 3, 5, 6-四氯酚、2, 3, 4, 6-四氯酚、2, 3, 4, 5-四氯酚、 2, 4, 5_二氣酸、3, 4, 5_二氣酸、2, 3, 4_二氣酸、2, 3, 5_二氣酸、五漠酸、2, 4, 6_二漠酸、四氣 儿茶酸、2, 3, 6_二氣酸、2, 4, 6_二氣酸、2, 3_二氣酸、2, 4_二氣酸、2, 5_二氣酸、2, 6_二氣 酚、3, 4-二氯酚、3, 5-二氯酚、2- -氯酚、3- -氯酚或4- 一氯酚；
[0014] 所述羰基氰类为羰基-氰-对_三氟甲氧基苯肼或羰基氰化物间氯苯腙；
[0015]所述非留体类抗炎药为托芬那酸（Tolfenamicacid)、氟芬那酸（Flufenamic acid)、甲芬那酸（Mefenamicacid)、尼氟灭酸（Niflumicacid)、甲氯芬那酸 (Meclofenamicacid)或双氯芬酉爱（Diclofenicacid)；
[0016] 所述阳离子Ru(II)金属络合物具体为式I所示的[Ru(bpy)2dppz]2+或式II所示 的[Ru(phen)2dppz]2+;
[0017] 所述卤代酚类具体为五氯酚；
[0018] 所述羰基氰类具体为羰基-氰-对-三氟甲氧基苯肼；
[0019] 所述非留体类抗炎药具体为托芬那酸。
[0020] 上述方法中，所述细胞为真核细胞或原核细胞；所述真核细胞为QSG-7701细 胞、HeLa细胞、IfepG-2细胞、HL-7702细胞、MCF-7细胞或PC-12细胞；所述原核细胞为 Staphylococcusaureus；
[0021] 所述细胞具体为QSG-7701细胞。
[0022] 上述方法中，所述培养体系为含有体积分数为10%胎牛血清（FBS)和体积分数为 1 %的双抗青-链霉素的RMP1640培养基；或所述培养体系为含有体积分数为1 %的双抗 青-链霉素的RMP1640培养基。
[0023] 上述方法中，所述培养细胞的时间为l_3h;所述培养细胞的温度为37°C。
[0024] 本发明的另一个目的是提供上述方法的新用途。
[0025] 本发明提供了上述方法在促进阳离子Ru(II)金属络合物进入活细胞的细胞核中 的应用。
[0026] 本发明还提供了上述方法在促进阳离子Ru(II)金属络合物进入活细胞中的应 用。
[0027] 本发明还提供了上述方法在增加阳离子Ru(II)金属络合物在细胞内的荧光强度 中的应用。
[0028] 本发明还有一个目的是提供一种活细胞内DNA结构荧光探针的产品。
[0029] 本发明提供的活细胞内DNA结构荧光探针的产品由阳离子Ru(II)金属络合物和 生物化学试剂组成；所述生物化学试剂为卤代酚类、羰基氰类或非留体类抗炎药。
[0030] 上述产品中，所述阳离子Ru(II)金属络合物与所述生物化学试剂的物质的摩尔 比为（1-5) : 3 ;
[0031 ] 所述阳离子Ru(II)金属络合物为式I所示的[Ru(bpy) 2dppz]2+、式II所示 的[Ru(phen)2dppz]2+、式 III所示的[Ru(DIP)2dppz]2+或式 IV所示的[Ru(bpy)2tpphz Ru(bpy) 2]4+；
[0032] 所述卤代酚类为五氯酚、2, 3, 5, 6-四氯酚、2, 3, 4, 6-四氯酚、2, 3, 4, 5-四氯酚、 2, 4, 5_二氣酸、3, 4, 5_二氣酸、2, 3, 4_二氣酸、2, 3, 5_二氣酸、五漠酸、2, 4, 6_二漠酸、四氣 儿茶酸、2, 3, 6_二氣酸、2, 4, 6_二氣酸、2, 3_二氣酸、2, 4_二氣酸、2, 5_二氣酸、2, 6_二氣 酚、3, 4-二氯酚、3, 5-二氯酚、2- -氯酚、3- -氯酚或4- 一氯酚；
[0033] 所述羰基氰类为羰基-氰-对-三氟甲氧基苯肼或羰基氰化物间氯苯腙；
[0034] 所述非留体类抗炎药为托芬那酸、氟芬那酸、甲芬那酸、尼氟灭酸、甲氯芬那酸或 双氯芬酸；
[0035] 所述阳离子Ru(II)金属络合物具体为式I所示的[Ru(bpy)2dppz]2+或式II所示 的[Ru(phen)2dppz]2+;
[0036] 所述卤代酚类具体为五氯酚；
[0037] 所述羰基氰类具体为羰基-氰-对-三氟甲氧基苯肼；
[0038] 所述非留体类抗炎药具体为托芬那酸。
[0039] 上述产品中，所述细胞为真核细胞或原核细胞；所述真核细胞为QSG-7701细 胞、HeLa细胞、IfepG-2细胞、HL-7702细胞、MCF-7细胞或PC-12细胞；所述原核细胞为 Staphylococcusaureus；
[0040] 所述细胞具体为QSG-7701细胞。
[0041] 本发明的最后一个目的是提供生物化学试剂的新用途。
[0042] 本发明提供了生物化学试剂在制备促进阳离子Ru(II)金属络合物进入活细胞的 细胞核的产品中的应用。
[0043] 本发明还提供了生物化学试剂在制备促进阳离子Ru(II)金属络合物的活细胞的 细胞核摄取的产品中的应用。
[0044] 本发明还提供了生物化学试剂在制备促进阳离子Ru(II)金属络合物进入活细胞 的产品中的应用。
[0045] 本发明还提供了生物化学试剂在制备促进阳离子Ru(II)金属络合物的活细胞摄 取的产品中的应用。
[0046] 本发明还提供了生物化学试剂在增加阳离子Ru(II)金属络合物在细胞内的荧光 强度中的应用。
[0047] 上述应用中，所述生物化学试剂为卤代酚类、羰基氰类或非留体类抗炎药；
[0048] 所述阳离子Ru(II)金属络合物为式I所示的[Ru(bpy) 2dppz]2+、式II所示 的[Ru(phen)2dppz]2+、式 III所示的[Ru(DIP)2dppz]2+或式 IV所示的[Ru(bpy)2tpphz Ru(bpy) 2]4+；
[0049] 所述卤代酚类为五氯酚、2, 3, 5, 6-四氯酚、2, 3, 4, 6-四氯酚、2, 3, 4, 5-四氯酚、 2, 4, 5_二氣酸、3, 4, 5_二氣酸、2, 3, 4_二氣酸、2, 3, 5_二氣酸、五漠酸、2, 4, 6_二漠酸、四氣 儿茶酸、2, 3, 6_二氣酸、2, 4, 6_二氣酸、2, 3_二氣酸、2, 4_二氣酸、2, 5_二氣酸、2, 6_二氣 酚、3, 4-二氯酚、3, 5-二氯酚、2- -氯酚、3-