一种大豆遗传转化方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种大豆遗传转化方法。
【背景技术】
[0002] 大豆（GlycinemaxL.Merr.)是重要的粮油兼用作物，也是目前转基因品种种植 面积最大的作物。由于传统育种方法存在的局限性，使得转基因技术成为大豆新品种培育 的重要手段。
[0003] 大豆目前使用较为广泛的大豆转化体系，以根癌农杆菌介导的子叶节转化体系和 基因枪介导的幼胚转化体系为主。由于基因枪介导的幼胚转化受外植体取材的限制，实际 应用中主要还是采用根癌农杆菌介导的子叶节转化方法。根癌农杆菌转化体系周期长（通 常是用发芽5天的种子制备外植体）、转化效率低，制约着大豆分子育种的发展。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种大豆遗传转化方法。
[0005] 本发明提供了一种制备大豆外植体的方法，包括如下步骤：取发芽Id的大豆种 子，制备大S?外植体。
[0006] 所述制备大豆外植体的方法可为：取种子，剥去种皮，从胚轴处将子叶从中间一分 为二，在子叶和胚轴连接的部位平行划伤5-7次（具体可为6次）。
[0007] 所述发芽Id的大豆种子的制备方法可为：将灭菌后的大豆种子接种于发芽培养 基上，培养1天。所述培养的条件可为：温度为24°C;每天光照16小时，黑暗8小时。所述 灭菌具体可为氯气灭菌。所述氯气灭菌的方法具体可为：将大豆种子平铺在培养皿中，然 后将培养皿放入干燥器中，在干燥器中放入一个100ml容量的烧杯（向烧杯中先倒入80ml 浓度为12M的次氯酸钠水溶液，再缓慢加入4ml浓盐酸），然后迅速盖上干燥器，用凡士林 密封，放置12-16小时（具体可为14小时）。所述发芽培养基的制备方法可为：将3.lgB5 盐、30g蔗糖、lmlB5有机和7. 5g琼脂溶于1L水。
[0008] 所述大豆具体可为大豆品种Jack。
[0009] 本发明还保护以上任一所述方法制备得到的大豆外植体。
[0010] 本发明还保护以上任一所述方法制备得到的大豆外植体在大豆遗传转化中的应 用。
[0011] 本发明还保护一种大豆遗传转化方法，包括如下步骤：对以上任一所述方法制备 得到的大豆外植体进行遗传转化。
[0012] 所述"对以上任一所述方法制备得到的大豆外植体进行遗传转化"的方法如下：
[0013] (1)将"对以上任一所述方法制备得到的大豆外植体进行遗传转化"置于侵染菌液 中，室温浸泡2小时；所述侵染菌液为重组农杆菌菌悬液；所述重组农杆菌通过将含有目的 基因的重组表达载体导入出发农杆菌得到；
[0014] (2)完成步骤（1)后，取外植体，采用子叶内面向上的方式在共培养培养基上培养 5天；
[0015] (3)完成步骤（2)后，取外植体，在恢复培养基上培养7天；
[0016] (4)完成步骤（3)后，取外植体在筛选培养基上培养21天；
[0017] (5)完成步骤（4)后，取外植体，切除子叶部分，将丛生芽转接到伸长培养基上，培 养至丛生芽伸长3_4cm;
[0018] (6)完成步骤（5)后，取植株，剪取茎基部以上部分，先用lmg/ml吲噪丁酸水溶液 浸泡茎基部，然后在生根培养基上培养至生根。
[0019] 所述步骤⑵具体为：完成步骤⑴后，取外植体，将子叶内面（平滑面）向上，平 铺于已铺有无菌滤纸的共培养培养基上，培养5天。
[0020] 所述步骤（6)具体为：完成步骤（5)后，取植株，剪取茎基部以上部分，先用lmg/ ml吲哚丁酸水溶液浸泡茎基部lmin，然后在生根培养基上培养至生根。
[0021] 所述步骤⑵中，所述培养的条件可为：温度22°C海天光照16小时，黑暗8小时。 所述步骤（3)中，所述培养的条件可为：温度25°C;每天光照16小时，黑暗8小时。所述步 骤（4)中，所述培养的条件可为：温度25°C;每天光照16小时，黑暗8小时。所述步骤（5) 中，所述培养的条件可为：温度25°C;每天光照16小时，黑暗8小时。所述步骤（6)中，所 述培养的条件可为：温度25°C;每天光照16小时，黑暗8小时。
[0022] 所述液体培养基的制备方法可为：将0. 43g MS盐、40mg乙酰丁香酮、150mg二硫苏 糖醇、100mg L-半胱氨酸、30g蔗糖、lml B5有机和3. 9g 2-吗啉乙磺酸溶于1L水；pH5. 4。 所述共培养培养基的制备方法可为：将〇.43g MS盐、40mg乙酰丁香酮、150mg二硫苏糖醇、 100mg L-半胱氨酸、30g蔗糖、7.5g琼脂、lml B5有机和3.9g 2-吗啉乙磺酸溶于1L水； PH5. 4。所述恢复培养基的制备方法可为：将3. lg B5盐、0. 98g2-吗啉乙磺酸、30g蔗糖、 7. 5g琼脂、lml B5有机、150mg头孢霉素、150mg特美汀和lmg 6-BA溶于1L水；pH5. 4。所 述筛选培养基的制备方法可为：将3. lg B5盐、0. 98g 2-吗啉乙磺酸、30g蔗糖、7. 5g琼脂、 lml B5有机、150mg头孢霉素、150mg特美汀、lmg 6-BA和8mg草丁膦溶于1L水；pH5. 4。所 述伸长培养基的制备方法可为：将4. 0g MS盐、0. 6g 2-吗啉乙磺酸、30g蔗糖、7. 5g琼脂、 lml B5有机、150mg头孢霉素、150mg特美汀、O.lmg IAA、0.5mg GA、lmg 6-BA和8mg草丁膦 溶于1L水；pH5. 6。所述生根培养基的制备方法可为：将2. 165g MS盐、0. 6g 2-吗啉乙磺 酸、20g蔗糖、7. 5g琼脂和lml B5有机溶于1L水；pH5. 7。
[0023] 所述重组表达载体具体可为pTFlOl. 1载体。所述出发农杆菌具体可为根癌农杆 菌EHA101。
[0024] 所述侵染菌液的制备方法具体为：将所述重组表达载体导入根癌农杆菌EHA101， 得到重组农杆菌；用液体培养基重悬所述重组农杆菌，得到〇D_nni= 0. 6的浸染菌液。液体 培养基的制备方法具体可为：将〇. 43gMS盐、40mg乙酰丁香酮、150mg二硫苏糖醇、100mg L-半胱氨酸、30g蔗糖、lmlB5有机和3. 9g2-吗啉乙磺酸溶于1L水；pH5. 4。
[0025] 所述大豆具体可为大豆品种Jack。
[0026] 因此，本发明通过选取不同时期的大豆子叶为外植体，缩短了转化周期，并且提高 了大豆转化效率。本发明对于大豆的遗传转化具有重要的应用价值。
【附图说明】
[0027] 图1为实施例1的步骤一的2中培养5天的种子。
[0028] 图2为实施例1的步骤一的3中子叶一分为二后的照片。
[0029] 图3为实施例1的步骤三中培养5天的外植体。
[0030] 图4为实施例1的步骤四中的照片。
[0031 ] 图5为实施例1的步骤五中的照片。
[0032] 图6为实施例1的步骤六中培养15天的照片。
[0033] 图7为实施例1的步骤八中的照片。
[0034] 图8为实施例2的步骤一的2中培养1天的种子。
[0035] 图9为实施例2的步骤一的3中子叶一分为二后的照片。
[0036] 图10为实施例2的步骤三中培养5天的外植体。
[0037] 图11为实施例2的步骤四中的照片。
【具体实施方式】
[0038] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为 自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果 取平均值。B5 盐（GAMBORGBASALSALTMIXTURE):购自Phytotech公司，货号G768。MS 盐（MURASHIGE&SKOOGBASALSALTMIXTURE):购自Phytotech公司，货号M524。B5 有机 (GAMBORGVITAMINSOLUTION，1000x):购自Phytotech公司，货号G219。
[0039] 发芽培养基的制备方法：将3.lgB5盐、30g蔗糖、lmlB5有机和7. 5g琼脂溶于1L 水。
[0040] 液体培养基的制备方法：将0. 43gMS盐、40mg乙酰丁香酮、150mg二硫苏糖醇、 100mgL-半胱氨酸、30g鹿糖、lmlB5有机和3. 9g2-吗啉乙磺酸溶于1L水；pH5. 4。
[0041] 共培养培养基的制备方法：将0? 43gMS盐、40mg乙酰丁香酮、150mg二硫苏糖醇、 100mgL-半胱氨酸、30g蔗糖、7.5g琼脂、lmlB5有机和3.9g2-吗啉乙磺酸溶于1L水； pH5. 4。
[0042] 恢复培养基的制备方法：将3.lgB5盐、0. 98g2-吗啉乙磺酸、30g蔗糖、7. 5g琼 脂、lmlB5有机、150mg头孢霉素、150mg特美汀和lmg6-BA溶于1L水；pH5. 4。
[0043] 筛选培养基的制备方法：将3.lgB5盐、0. 98g2-吗啉乙磺酸、30g蔗糖、7. 5g琼 脂、lmlB5有机、150mg头孢霉素、150mg特美汀、lmg6-BA和8mg草丁膦溶于1L水；pH5.4。
[0044] 伸长培养基的制备方法：将4. 0gMS盐、0. 6g2-吗啉乙磺酸、30g蔗糖、7. 5g琼脂、 lmlB5 有机、150mg头孢霉素、150mg特美汀、O.lmgIAA、0.5mgGA、lmg6-BA和 8mg草丁膦 溶于1L水；pH5. 6。
[0045] 生根培养基的制备方法：将2. 165gMS盐、0.6g2-吗啉乙磺酸、20g蔗糖、7. 5g琼 脂和lmlB5有机溶于1L水；pH5. 7。
[0046] 大豆品种Jack:在国家农作物种质保存中心（依托单位为中国农业科学院作物科 学研究所）长期保存，可免费提供给国内从事大豆科研工作的研究人员使用。
[0047]pTFlOl. 1载体（vectorpTFlOl. 1):公众可从中国农业科学院作物科学研 究所获得；记载过该材料的非专利文献：PazM，ShouH，GuoZ,ZhangZ，Banerjee A，etal.AssessmentofconditionsaffectingAgrobacterium-mediatedsoybean transformationusingthecotyledonarynodeexplant.Euphytica. 2004, 136:167 - 179〇
[0048] 根癌农杆菌EHA101 :公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得；记载过该 材料的非专利文献：Hood.EE,Helmer.GL,Fraley.RT,Chilton.MD.Thehypervirulence ofAgrobacteriumtumefaciensA281isencodedinaregionofpTiBo542outside ofT-DNA.J.Bacteriol.,1986, 168(3):1291-1301.FrameBR,ShouH,ChikwambaRK,et al.