专利名称：一种适合单子叶植物转化的中间表达载体及其构建方法
技术领域：
本发明涉及一种植物遗传转化的中间表达载体及其构建方法。
背景技术：
我国粮食作物主要以小麦、水稻和玉米为主，而这三种作物都属于单子叶植物，其中小麦和水稻是重要口粮，玉米则是重要的粮食、饲料作物，同时也是制药、糖料、淀粉、油料、酒精工业等的主要原料。玉米的遗传转化研究具有广泛的应用和理论意义。目前应用的主流玉米遗传转化方法是基因枪转化法和农杆菌介导法，其中农杆菌转化方法因为有整合模式可能相对简单、外源基因表达传代可能相对稳定，操作简便、成本低，也可转移大片段DNA等优点而为玉米基因工程研究广泛利用。农杆菌介导法在双子叶植物上的遗传方法已经十分完善，由于玉米属单子叶植物，而单子叶植物不是农杆菌的天然宿主，因此使用合适的植物表达载体尤为重要。一个基因的正常表达需要有表达组件及启动子和终止子的调控。在载体中往往需要有一个多克隆位点插入表达组件中，这样方便外源基因插入到表达载体中而完成一个目的基因的表达载体的构建。另一方面基因工程中常用的CaMV35S启动子也在双子叶植物中表达效果好，在单子叶植物中通常使用Ubiquitin启动子,这在玉米、水稻等单子叶植物中已经得到了验证。因此，针对玉米遗传转化应选用单子叶植物中表达效果好的启动子，构建成一种具有完整表达组件，可以插入目的基因，构建适用于除草剂筛选、无报告基因的中间表达载体，具有很大的实际应用价值。
发明内容
本发明提供一种适合单子叶植物遗传转化的标准化中间表达载体。本发明所述的适合单子叶植物转化的中间表达载体为pCAM-UPN，其核苷酸序列如SEQ ID N0.4 所示。本发明提供的含有玉米Ubiquitin启动子-多克隆位点-终止子序列的中间表达载体，是将Ubiquitin启动子-多克隆位点-终止子序列插入双元载体的多克隆位点构建得到；其中所述的双元载体为PCAMBIA3300 ;其中所述的多克隆位点为人工合成序列，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。所述的玉米Ubiquitin启动子为玉米Ubiquitin启动子+内含子序列，其核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。所述的终止子为NOS终止子，其核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。本发明提供的适合单子叶植物遗传转化的标准化中间表达载体pCAM-UPN，其多克隆位点有5个限制性内切酶酶切位点，启动子上游和终止子下游分别有I个限制性内切酶酶切位点。 本发明提供了所述中间表达载体构建的应用 ，构建植物表达载体PCAM-UGN，其核苷酸序列如SEQ ID N0.5所示。本发明提供了含有所述中间表达载体构建的植物表达载体pCAM-UGN的宿主细胞。(实施例中没有体现？已经有所表诉)本发明提供了上述中间表达载体所构建的植物表达载体pCAM-UGN在基因转化中的应用。本发明提供了上述中间表达载体所构建的植物表达载体pCAM-UGN在水稻和玉米遗传转化中的应用。本发明还提供了中间表达载体pCAM-UPN的构建方法，包括下列步骤:(I)克隆玉米Ubiquitin启动子Ub1-P,在启动子的上下游分别填加了 Hind III和BamH I位点，用于扩增Ub1-pro的引物为:Ubi_P HinFw:5 ' CCCAAGCTTGGG GCATGCCTGCAGTGCAGCGTGAC3 '和 Ub1-P BamRev:5 ' CGCGGATCCGCGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGAA3'，将扩增得到的 Ub1-P 与 pMD18_T simple 载体连接，得到载体 pMD18-UP ；(2)克隆Nos终止子Nos-T，在终止子的上下游分别填加了 Sac I和EcoR I位点，用于扩增 Nos-T 的引物为:NosSacFw:5 ' CGAGCTCGGAATTTCCCCGATCGTTCA 3 '和 NosEcoRRev:5/ CCGGAATTCCCGATCTAGTAACATAGAT3'，将扩增得到的 Nos-T 与 pMD18_T simple载体连接，得到载体PMD18-NT ；(3)人工合成多克隆位点，利用BamH I和Sac I位点插入pCAMBIA3300，得到载体pCAM-NP ；(4)将载体pMD18-UP和载体pCAM-NP的质粒分别用Hind III和BamH I双酶切，回收目的片段和载体片 段进行连接，得到载体pCAM-UP ；(5)将载体pMD18-NT和载体pCAM-UP的质粒分别用Sac I和EcoR I双酶切，回收目的片段和载体片段进行连接，得到中间表达载体pCAM-UPN。本发明提供的中间表达载体pCAM-UPN具有完整的由启动子-多克隆位点_终止子序列构成的表达组件，它可以完整独立地驱动插入基因的表达。在该载体的多克隆位点有5个限制性内切酶酶切位点，可以将外源基因直接插入此多克隆位点即可构建出植物表达载体；在启动子上游和终止子下游分别有I个限制性内切酶酶切位点。本发明提供的pCAM-UPN含有Bar基因作为筛选标记，编码草胺磷乙酰转移酶，转基因材料用除草剂Basta进行筛选，避免了转基因后代用抗生素筛选引起争议；本发明中的中间表达载体本身不含报告基因，已经通过限制性内切酶将报告基因GUS插入载体，构建得到植物表达载体pCAM-UGN。利用基因枪轰击法将pCAM-UGN转入玉米愈伤组织，组织化学染色结果表明载体所带的⑶S基因在玉米中正常表达。农杆菌介导法将pCAM-UGN转入水稻，PCR鉴定后得到⑶S基因插入阳性植株，组织化学染色结果表明载体所带⑶S基因在水稻中正常表达。本发明提供的中间表达载体pCAM-UPN所构建的植物表达载体在玉米遗传转化中得到优于其他转化载体的结果。
图1是本发明pCAM-UPN的载体图谱，载体骨架为pCAMBIA3300 ；图2是植物表达载体pCAM-UGN的载体图谱，载体骨架为pCAMBIA3300 ；
图3是植物表达载体pCAM-UGN转化的玉米愈伤组织⑶S染色图片；图4A是植物表达载体pCAM-UGN在水稻中的表达，图中为用PCR检测TO代转基因水稻的PCR检测结果；+为质粒DNA对照，-为阴性对照，1-5为TO代转基因植株；图4B是植物表达载体pCAM-UGN在水稻中的表达，图中为TO代转化植株的⑶S染色结果，1-5为TO代转基因植株。
具体实施例方式本发明所述的适合单子叶植物转化的中间表达载体为pCAM-UPN，其核苷酸序列如SEQ ID N0.4 所示。本发明提供的含有玉米Ubiquitin启动子-多克隆位点-终止子序列的中间表达载体，是将Ubiquitin启动子-多克隆位点-终止子序列插入双元载体的多克隆位点构建得到；其中所述的双元载体为PCAMBIA3300 ;其中所述的多克隆位点为人工合成序列，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。所述的玉米Ubiquitin启动子为玉米Ubiquitin启动子+内含子序列，其核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。所述的终止子为NOS终止子，其核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。本发明提供的适合单子叶植物遗传转化的标准化中间表达载体pCAM-UPN，其多克隆位点有5个限制性内切酶酶切位点，启动子上游和终止子下游分别有I个限制性内切酶酶切位点。本发明提供了所述中间表达载体构建的应用，构建植物表达载体pCAM-UGN，其核苷酸序列如SEQ ID N0.5所示。本发明提供了含有所述中间表达载体构建的植物表达载体pCAM-UGN的宿主细胞。本发明提供了上述中间表达载体所构建的植物表达载体pCAM-UGN在基因转化中的应用。本发明提供了上述中间表达载体所构建的植物表达载体pCAM-UGN在水稻和玉米遗传转化中的应用。本发明还提供了中间表达载体pCAM-UPN的构建方法，包括:(I)克隆玉米Ubiquitin启动子Ub1-P,在启动子的上下游分别填加了 Hind III和BamH I位点，用于扩增Ub1-pro的引物为:Ubi_P HinFw:5 ' CCCAAGCTTGGG GCATGCCTGCAGTGCAGCGTGAC3 '和 Ub1-P BamRev:5 ' CGCGGATCCGCGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGAA3'，将扩增得到的 Ub1-P 与 pMD18_T simple 载体连接，得至Ij载体 pMD18-UP ；(2)克隆Nos终止子Nos-T，在终止子的上下游分别填加了 Sac I和EcoR I位点，用于扩增 Nos-T 的引物为:No s SacFw:5 ' CGAGCTCGGAATTTCCCCGATCGTTCA3 '和 NosEcoRRev:5/ CCGGAATTCCCGATCTAGTAACATAGAT3'，将扩增得到的 Nos-T 与 pMD18_T simple载体连接，得到载体PMD18-NT ；(3)人工合成多克隆位点，利用BamH I和Sac I位点插入pCAMBIA3300，得到载体pCAM-NP ；
(4)将载体pMD18-UP和载体pCAM_NP的质粒分别用Hind III和BamH I双酶切，回收目的片段和载体片段进行连接，得到载体pCAM-UP ；(5)将载体pMD18-NT和载体pCAM_UP的质粒分别用Sac I和EcoR I双酶切，回收目的片段和载体片段进行连接，得到中间表达载体pCAM-UPN。下面结合具体实施例对发明做进一步说明。实验材料质粒:pMD18_Tsimple (大连 TaKaRa 公司)，pCAMBIA3300 (Cambia Labs)；菌株:大肠杆菌Trans5 α (北京全式金公司)，农杆菌EHA105 (本实验室保存)；下述实施例中所用的方法如无特别说明，均为常用分子生物学、组织培养技术和基因工程所记载的方法。具体步骤可参见:《Molecular Cloning:A LaboratoryManual)) (Sambrook, J., Russell, David ff., Molecular cloning:A Laboratory Manual,3rdedition, 2001, NY, Cold Spring Harbor)。各种试剂及内切酶:购自大连 TaKaRa 公司，上海捷瑞生物科技有限公司，基因合成由上海捷瑞生物科技有限公司完成，测序分析由华大基因完成。实施例1
1.克隆载体pCAM-NP的构建按照SEQ ID N0.1设计序列有生物公司合成多克隆位点，此多克隆位点含有BamHI, Spe 1、Sma 1、Xma I和Sac I五个限制性内切酶酶切位点，将多克隆位点插入PCAMBIA3300 (购自 Cambia 公司)，得到 pCAM-NP。2.载体pCAM-UP的构建根据SEQ ID N0.2命名为Ubi序列，设计Ubiquitin启动子引物，上下游引物分别插入Hind III和BamH I酶切位点:Ub1-P HinFw:5/ CCCAAGCTTGGG GCATGCCTGCAGTGCAGCGTGAC3'Ub1-P BamRev:5/ CGCGGATCCGCG GATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGAA3'用Ub1-P HinFw和Ub1-PBamRev引物，以质粒pAHC17为模板，进行PCR扩增，得到一个2000bp左右的片段，将此片段连入pMD18-T simple，合成载体pMD18_UP，测序分析无误后，利用Hind III和BamH I双酶切pMD18_UP得到插入片段，取pCAM-NP (由生物公司合成)用同样的酶切回收载体片段，用连接酶重组连接上述插入片段和载体片段，抽提质粒后测序插入无误后得到载体pCAM-UP。3.载体 pCAM-UPN 的构建根据用SEQ ID N0.3命名为Nos序列，设计NOS终止子引物，上下游引物分别插入Sac I和EcoR I酶切位点:Nos SacFw:5/ CGAGCTCGGAATTTCCCCGATCGTTCA3'Nos EcoRRev:5/ CCGGAATTCCCGATCTAGTAACATAGAT3'用Nos SacFw和Nos EcoRRev引物，以pBI121为模板，进行PCR扩增，得到一个270bp左右的片段，将扩增得到的片段与pMD18-T simple载体连接，得到载体pMD18_NT，测序验证无误后，利用Sac I和EcoR I双酶切pMD18_NT得到插入片段，取pCAM-UP (上一步构建载体)用同样的酶切回收载体大片段，用连接酶重组连接上述插入片段和载体片段，抽提质粒后测序插入无误后，得到中间表达载体pCAM-UPN(图1)。
实施例2:1.植物表达载体pCAM-UGN的构建2.为了研究并验证本发明载体pCAM-UPN的实用性及稳定性，以⑶S报告基因为目的基因连接到载体的BamHI和SacI酶切位点，构建成植物表达载体pCAM-UGN。具体步骤如下:(I)⑶S基因的克隆根据NCBI网站数据库提供的序列信息，设计Gus基因的PCR引物，上下游分别插A BamH I 和 Sac I 位点:⑶SBamFwj' CGGGATCCCGATGTTACGTCCTGTAGAAACCCCA3'⑶SSacRevj' CGAGCTCGTCCCTGCTGCGGTTTTTCACCGAAG3'以质粒pCAMBIA3301 (购自Cambia公司)为模板，利用上述PCR引物通过PCR扩增得到⑶S基因序列。⑶S基因PCR产物回收后连接于PMD18-T simple载体，测序无误后得到pMD18-⑶S。(2)植物表达载体pCAM-UGN的构建及测序 将pMD18-GUS和中间表达载体pCAM-UPN的质粒分别用BamH I和Sac I酶切，分别回收GUS目的基因和载体片段，用连接酶连接目的基因和载体片段，抽提重组质粒后测序确定插入无误，得到植物表达载体pCAM-UGN(图2)，序列如SEQ ID N0.5所示。实施例3: 1.表达载体pCAM-UGN在玉米愈伤组织中的表达研究(I)基因枪法轰击玉米愈伤组织采用基因枪介导法将插入序列导入受体植株幼胚脱分化获得的愈伤组织细胞，经除草剂草铵膦筛选后获得转基因植株。具体方法为:I)收获授粉后9-12天的幼穗，除掉苞叶，灭菌后用无菌水洗涤，剥取大小在1.5-2.0mm的幼胚，将幼胚接种于愈伤组织诱导与继代培养基，28°C，暗培养2周。以后每2周继代一次，直到形成稳定的II型愈伤组织。2).将带有质粒pCAM-UGN的大肠杆菌DH5 α在附加抗生素的LB培养基中37°C震荡培养，使细菌处于对数生长期，提取质粒，调整质粒浓度在1.0 μ g/μ 1，_20°C保存待用。洗涤直径0.6 μ m的金粉，-20°c保存待用。3).将稳定的II型愈伤组织转移到高渗培养基，愈伤组织紧密地摆放在培养基中心,形成一个直径约为3.5cm左右的圆形,高渗处理4-6h后,制备金弹进行基因枪轰击。4).基因枪轰击后的愈伤组织在高渗培养基中继续培养20h，然后转移到诱导与继代培养基恢复培养I周，再转入带有一定浓度的除草剂草铵膦的筛选培养基中进行筛选培养，每2周更换一次培养基，直到筛选出抗性愈伤组织。(2)表达载体pCAM-UGN在玉米愈伤组织中的组织化学染色⑶S染色:I)将基因枪轰击后培养48h的抗性愈伤材料浸入0.4%甲醒溶液中，室温下45min2).用0.1M pH7.0的磷酸盐缓冲液冲洗植物组织3遍3).将玉米材料浸入底物工作液中，37°C孵育过夜4).75%乙醇浸泡I天，以脱去背景颜色
5).观察玉米材料蓝色斑点，统计、照相(图3)，说明植物表达载体pCAM-UGN表达的⑶S蛋白在玉米愈伤组织(植物宿主材料)中成功表达。同时说明pCAM-UPN中间表达载体构建的表达载体可以正常行驶功能，可应用于玉米宿主材料的转化研究。(染色液成分:0.5mg/ml X-Gluc+lOOmM 憐酸钾缓冲液(pH = 7.0) +0.1 % TritonX-100+0.5mMK3Fe(CN)6+0.5mM K4Fe(CN)6+1OmM EDTA)实施例4:表达载体pCAM-UGN在水稻中的表达研究(I)表达载体pCAM-UGN转化农杆菌EHA105向50ul农杆菌EHA105感受态细胞中加入lug pCAM-UGN质粒DNA，冰浴30min ;放入液氮中lmin，然后立即放入37°C水浴锅中水浴5min ;取出离心管，加入0.5ml YEP培养基，28°C，220rpm振荡培养3_5hr ;取出菌液涂于含有相应抗生素的YEP平板上，在28°C培养箱中倒置培养2天，直到菌落出现。(2)重组农杆菌鉴定挑取单菌落，接种于含有相应抗生素的YEP液体培养基中，28°C振荡培养过夜。碱裂解法提取质粒DNA并酶切鉴定。(3)转化水稻采用根瘤农杆菌介导法将插入序列导入水稻的胚性愈伤组织(植物宿主细胞)，经除草剂PPT筛选后获得转基因植株。具体方法为:I)取成熟水稻种子，外壳碾去，70%酒精浸泡5min，然后在0.1 %的氯化汞溶液中消毒，用无菌水洗涤2-3次，放入诱导培养基中，26°C暗培养。21-28天后将从盾片诱导的愈伤组织转入继代培养基中，2周继代I次，将得到的胚性愈伤组织作为农杆菌转化的受体。2)将带有pCAM-UGN的根瘤农杆菌EHA105在附加抗生素的YEP培养基中28°C震荡培养，使细菌处于对数生长期。然后在3000r/min下离心10分钟，弃上清液。菌体用1/2改良MS液体培养基洗涤，离心收集。再将菌体用添加100mg/l乙酰丁香酮的1/2MS改良液体培养基悬浮，稀释5-20倍用于转化。3)把菌液倒在培养皿中，将挑好的胚性愈伤组织浸泡在菌液中5分钟。然后将浸染后的胚性愈伤组织用无菌滤纸吸干，转入N6选择培养基(含有5mg/ml PPT)中于26°C暗培养20天后，继代I次。将新长出的抗性愈伤转移到N6预分化培养基上，26°C、60uE/ (m2,s)强度、12h可持续光照。待小苗长到约Icm时放入含有1/2MS盐的生根培养基中，待长出3-4条根长度为1.5cm时，转入温室。4)移栽成活的转化植株长出3片叶后，将转基因水稻植株和未转化植株的叶片用含600mg/L PPT的BASTA除草剂溶液涂布，3-4天后观察叶片颜色变化，半月后筛选出存活植株定植到田间。5)抗除草剂植株生长到5-6叶时，取叶片提取DNA，采用PCR技术检测外源基因。⑷TO转基因植株的PCR检测提取除草剂5株抗性植株叶片基因组DNA，经PCR检测，有4株呈阳性(如图4，A)。说明pCAM-UGN植物表达载体能够成功整合到植物基因组中。(5) TO代转基因植株的组织化学染色⑶S染色:
I)将转基因水稻叶片浸入0.4%甲醒溶液中，室温下45min
2).用0.1M pH7.0的磷酸盐缓冲液冲洗植物组织3遍3).将玉米材料浸入底物工作液中，37°C孵育过夜4).75%乙醇浸泡I天，以脱去背景颜色5).观察水稻材料蓝色斑点，统计、照相(图4，B)，说明pCAM-UGN表达的⑶S蛋白在转基因水稻中可以稳定表达。同时说明pCAM-UPN中间表达载体构建的植物表达载体可以正常行驶功能，可应用于单子叶植物宿主材料的转化研究。(染色液成分:0.5mg/ml X-Gluc+100mM 憐酸钾缓冲液(pH = 7.0)+0.1 %TritonX-100+0.5mM K3Fe(CN)6+0.5mM K4Fe(CN)6+1OmM EDTA)实施例5:利用中间表达载体构建得到表达载体pCAM-UTN与p7U_UTN载体转化率比较本实施例中设计到的概念定义:转化事件，由一个幼胚获得的所有抗性愈伤均称为一个转化事件；转化率是转化事件数和侵染幼胚数的比值；利用本发明提供的中间表达载体PCAM-UPN，利用酶切重组法，在载体的多克隆位点插入不同的目的基因(Target gene)，构建了不同的植物表达载体pCAM_UT( 7 )N，分别命名为 pCAM-UT(GS1)N，pCAM-UT(AAP1)N，pCAM-UT(Dofl)N, pCAM-UT(GA2ra)N，对照载体 p7U-UT_)N ；表达载体转化农杆菌，方法同实施例3 ；侵染筛选基本流程:菌体活化，工程菌`制备，幼胚剥取，农杆菌侵染幼胚ΗΠΙ，(幼胚带菌)共培养，幼胚恢复培养(无除草剂，带抗生素抑菌)，筛选培养(带除草剂和抗生素)直到不再出抗性愈伤，计算转化率，各载体所得转化率不同(见表1)，总体看来利用pCAM-UPN构建的植物表达载体转化率普遍高于p7U所得载体，高出水平在4_30倍不等，证明了本发明所提供的中间表达载体的实用性和实效性。转化率％=转化事件数/侵染幼胚数X 100%表1:pCAM_UTN载体与p7U_UTN载体的转化率比较
权利要求
1.一种适合单子叶植物转化的中间表达载体，其核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示。
2.如权利要求1所述的适合单子叶植物转化的中间表达载体的构建方法，包括下列步骤: (1)克隆玉米Ubiquitin启动子Ub1-P，在启动子的上下游分别填加了Hind III和BamHI 位点，用于扩增 Ub1-pro 的引物为:Ub1-PHinFw:5’ CCCAAGCTTGGGGCATGCCTGCAGTGCAGCGTGAC3’ 和 Ub1-P BamRev: 5’CGCGGATCCGCGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGAA3 '，将扩增得到的Ub1-P 与 pMD18-Tsimple 载体连接，得到载体 pMD18_UP; (2)克隆Nos终止子Nos-T，在终止子的上下游分别填加了SacI和EcoRI位点，用于扩增 Nos-T 的引物为:NosSacFw: 5’CGAGCTCGGAATTTCCCCGATCGTTCA3’ 和 NosEcoRRev: 5’CCGGAATTCCCGATCTAGTAACATAGAT3,，将扩增得到的 Nos-T 与 pMD18_Tsimple 载体连接，得到载体PMD18-NT; (3)人工合成多克隆位点，利用BamHI和SacI位点插入pCAMBIA3300，得到载体pCAM-NP; (4)将载体pMD18-UP和载体pCAM-NP的质粒分别用HindIII和BamHI双酶切，回收目的片段和载体片段进行连接，得到载体pCAM-UP; (5)将载体pMD18-NT和载体pCAM-UP的质粒分别用SacI和EcoRI双酶切，回收目的片段和载体片段进行连接，得到中间表达载体PCAM-UPN。
3.如权利要求1所述的适合单子叶植物转化的中间表达载体在基因转化中的应用。
4.如权利要求1所述的适合单子叶植物转化的中间表达载体在水稻和玉米遗传转化中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种适合单子叶植物转化的中间表达载体及其构建方法，属于植物遗传转化的中间表达载体及其构建方法。该中间表达载体为pCAM-UPN，其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。本发明中的中间表达载体本身不含报告基因，己经通过限制性内切酶将报告基因GUS插入载体，构建得到植物表达载体pCAM-UGN。农杆菌介导法将pCAM-UGN转入水稻，PCR鉴定后得到GUS基因插入阳性植株，组织化学染色结果表明载体所带GUS基因在水稻中正常表达。
文档编号C12N15/82GK103205458SQ20131011328
公开日2013年7月17日 申请日期2013年3月31日 优先权日2013年3月31日
发明者贺红霞, 郝东云, 刘相国, 李晓辉, 袁英, 李楠, 郭嘉, 陈亮 申请人:吉林省农业科学院