(642)、C-Phycocyanin (648)、T0-PR0?-3 (660)、T0T03 (660)、DiD Di IC (5) (665)、Cy5? (670)、Thiadicarbocyanine (671)、Cy5.5 (694)、HEX (556)、TET (536)、B1search Blue (447)、CAL Fluor Gold 540(544)、CAL Fluor Orange 560 (559)、CAL Fluor Red 590(591)、CAL Fluor Red 610(610)、CAL Fluor Red 635 (637)、FAM(520)、Fluorescein (520)、Fluorescein_C3 (520)、Pulsar650 (566)、Quasar570 (667)，Quasar 670(705)及 Quasar705(610)。括号的数字为以纳米单位表示的最大发光波长。
[0034]淬灭分子是利用本发明所属技术领域中公知的能够对广范围波长或特定波长的焚光进行淬灭的非焚光黑淬灭分子，包括黑洞淬灭剂、(BHQ:black hole quencher ;包括BHQ1、BHQ2、BHQ3)、4-[4-( 二甲基氨基)苯偶氮]苯甲酸(DABCYL:4-[4-(Dimethylamino)phenylazo]benzoic acid)。
[0035]引物的FRET标记中，荧光报告分子包含FRET的供体，淬灭分子包含FRET的受体，例如，焚光素染料(fluorescein dye)为报告分子，罗丹明染料(rhodamine dye)为淬灭分子。
[0036]荧光报告分子和淬灭分子均位于引物的锚定序列区，并且，分别位于缺口剂识别序列的5’ -端和3’ -端的任意位置；或者，焚光报告分子和淬灭分子分别位于销定序列区和识别序列区，并且，分别位于缺口剂识别序列的5’ -端和3’ -端的任意位置。上述标记的共同特征是，由于引物通过其5’-端固定于固相芯片，在反应体系中存在靶分子的条件下，固定于固相芯片的引物因缺口剂在其缺口剂识别序列正义链的切割作用而释放荧光，该荧光因引物的5’-端固定作用而附着在固相芯片，从而可通过固相芯片固定的引物产生的荧光信号判断检测体系中存在靶分子，实现靶分子的定性检测。当反应体系中不存在其固定引物对应的靶分子的条件下，固定于固相芯片的引物不会被缺口剂切割，其荧光报告分子和淬灭分子因FRET作用而不产生荧光信号，此时，其固相芯片也不会检测到引物产生的可检测荧光信号，从而判断检测体系中不存在靶分子。同时，由于固相芯片固定的引物产生的可检测荧光信号强度与靶分子的初始丰度正相关，因此，可进一步通过固相芯片固定的引物释放的荧光强度实现靶分子的定量检测。
[0037]其工作的原理为:当反应体系中不存在miRNA革El分子时，固定于固相芯片的引物的荧光报告分子和淬灭分子因FRET作用使引物不产生荧光信号；当反应体系中存在miRNA靶分子时，上游引物、下游引物、miRNA靶分子及其所产生的miRNA靶分子互补链均能在DNA聚合酶的作用下形成完整的双链核酸分子，从而使切口剂能够切割固定于固相芯片的上游引物和/或下游引物的缺口剂识别序列正义链，此时，固定于固相芯片的荧光报告分子和淬灭分子失去了荧光共振能量转移作用而产生可检测的荧光信号。当反应体系中固相芯片有多个特定位点时，并且，每种特定位点上固定了靶分子特异性的上游引物和/或下游引物，就能够在同一个固相芯片同时定性和定量检测多种靶分子。例如，根据现有的本发明所属技术领域的公知技术，至少可在单个微阵列芯片中同时检测成百上千种miRNA靶分子。
[0038]如图1和图2所示，通过其5’-末端固定于固相芯片的上游引物和/或下游引物包含具有FRET作用的焚光报告分子和淬灭分子，并且，焚光报告分子和淬灭分子分别位于引物锚定序列区缺口剂识别序列的5’ -端和3’ -端任意位置(图1)，或者，荧光报告分子和淬灭分子分别位于引物锚定序列区和识别序列区，并且，分别位于缺口剂识别序列的5’-端和3’-端任意位置(图2)。未固定于固相芯片的上游引物和/或下游引物标记不包含FRET作用的荧光报告分子和淬灭分子(图1、图2)。当固定于固相芯片的引物被缺口剂切割时，可产生可检测的荧光信号，并且，由于其5’-端固定于固相芯片，因此，使固相芯片产生可产生的荧光信号，并且，该荧光信号具有靶分子特异性(图1、图2)。
[0039]如图3所示，上游引物Pl和下游引物P2的5’ 一3’碱基序列依次是缺口剂识别序列(nicking agent recognit1n sequences, NARS)正义链序列所在的销定序列区、特异性识别靶miRNA的识别序列区。上述引物具有以下三个显著特点(图1，2):引物Pl和P2的识别序列区分别与靶miRNA及其互补链(即:miRNA*)的3’-端序列互补，可在缺口酶和DNA聚合酶的协同作用下分别介导一个既独立又相互作用的“切割-延伸-链置换”线性扩增，最终，二者偶联成一个自主链式循环，最终实现靶miRNA的指数扩增；二者的识别序列区特定位置均可引入适当数量的LNA，从而提高扩增温度(达到55?65°C )，均一化不同GC含量miRNA的Tm值(介于50?55°C )，增强引物-模板单碱基错配的识别能力；二者可同时固定在固相芯片条件下(图2)，当引物与模板特异性结合并延伸成双链核酸分子后，缺口剂的切割将导致引物释放荧光。基本技术原理如图3所示:革巴miRNA与引物Pl互补结合，由于成熟miRNA及引物Pl均具有3’ -0H，可彼此延伸成完整双链核酸分子；缺口剂在NARS正义链序列切割引物P1，释放荧光信号，同时，该缺口的5’-端核酸分子，即引物5’-端锚定序列区所在核酸分子的3’ -端序列因具有3’ -0H,可进一步延伸，并在DNA聚合酶的链置换活性作用下，置换出与靶miRNA完全互补的新生DNA链(即:miRNA*)，从而形成第一个“切割-延伸-链置换”线性扩增；引物Pl释放的miRNA*又可按照相似原理，触发引物P2介导的第二个“切割-延伸-链置换”线性扩增，并释放与靶miRNA序列完全相同的新生DNA链(即:miRNA);第一个和第二个线性扩增通过各自释放的新生DNA链彼此偶联成一个自主链式循环，并且，每生成一个新生DNA链，均会导致一个引物Pl或P2释放荧光，反应体系释放的荧光强度与靶miRNA的起始量呈正比关系；当固相芯片的每个特定位点上只固定一种miRNA靶分子对应的上游引物和/或下游引物时，每种miRNA靶分子对应的上游引物和/或下游引物可标记相同的荧光报告分子，此时，每个特定位点只检测一种miRNA靶分子；或者，当固相芯片的每个特定位点固定两种或两种以上miRNA靶分子对应的上游引物和/或下游引物时，在此条件下，每个特定位点固定的每种miRNA靶分子对应的上游引物和/或下游引物标记不同的荧光报告分子，但不同特定位点固定的miRNA靶分子对应的上游引物和/或下游引物可标记相同的荧光报告分子，在此条件下，固相芯片在每个特定位点可检测两种或两种以上不同的miRNA靶分子。由于引物释放的荧光信号均附着于固相芯片，因此，可通过固相芯片每个特定位点释放的荧光信号种类和丰度实现多种靶分子的同时检测。
[0040]固相芯片的每个特定位点只固定miRNA靶分子对应的上游引物(图4)或下游引物(图5)。上述两种案例释放荧光信号的原理与固相芯片同时固定上游引物和下游引物(图3)相似，并不影响检测方法的灵敏度与特异性等方法学参数。
[0041]进一步，所述的固定于固相芯片的上游引物和/下游引物的锚定序列区5’-端增加多聚碱基，包括多聚胞腺嘧啶碱基(Poly(Tn))或多聚腺嘌呤碱基(Poly(An)),并通过所述多聚碱基的5’-末端固定于固相芯片。以简化上述引物固定于固相芯片，并且，能够最小化对酶作用(如:缺口剂的切割作用)的空间妨碍(space hindrance)，并增加引物与革巴分子的杂交效率，提高恒温扩增效率。Poly(Tn)或Poly(An)并不影响本发明所述引物的典型结构及其功能。
[0042]进一步，靶分子特异性上游引物和/或下游引物通过其5’ -末端直接或间接固定于固相芯片，固定的方式包括以共价键和非共份键的结合方式固定，或者，通过物理吸附和/或化学耦联方式固定，或者，具有胺基的烷基或者芳基化合物作为连接肽固定，或者，具有硫醇基的烷基或者芳基化合物作为连接肽固定引物，或者，通过手臂分子固定。其固定方法包含本发明所属技术领域中公知的固定技术，包括通过物理吸附和/或化学耦联方式将上游引物和/或下游引物连接于固相芯片，或者，包括具有胺基的烷基或者芳基化合物作为连接肽固定引物，或者，包括具有硫醇基的烷基或者芳基化合物作为连接肽固定引物，或者，包括在固相芯片和/或引物标记、修饰或合成有手臂分子，并通过二者之间的手臂分子、手臂分子与其它分子的相互作用将引物固定于固相芯片。
[0043]进一步，所述多个种类的miRNA靶分子相对应的上游引物和/或下游引物的锚定序列区、识别序列区均引入衍生核苷酸，衍生核苷酸包括锁核酸、肽核酸或硫代修饰碱基。
[0044]进一步，所述多个种类的miRNA靶分子相对应的上游引物和/或下游引物的识别序列区中含有与miRNA靶分子互补序列3’ -末端倒数第二位和/或第三位碱基错配的核苷酸；
[0045]或者，在所述反应混合物中加入可抑制非特异性扩增的生物活性分子，包括TaqMutS、RecA0
[0046]进一步，所述的DNA聚合酶是具有链置换活性的DNA聚合酶；或者所述的DNA聚合酶不具有链置换活性，且在所述反应混合物中加入具有链置换活性的生物活性分子。
[0047]进一步，所述的恒温的反应温度范围为16_70°C。
[0048]进一步，所述的恒温的反应温度为37°C、55°C、60°C或65°C。
[0049]进一步，所述的反应时间为10_80min。
[0050]进一步，所述的反应时间为10min、20min、30min、40min、50min 或 60min。
[0051]进一步，本发明还提供了利用本发明所述固相芯片实时恒温指数扩增方法的检测试剂或试剂盒，其主要特征及包含的反应成分包括:使用了本发明所述的上游引物和下游引物；固定了上游引物和/或下游引物的固相芯片；待检测物是miRNA靶分子或具有3’-OH其它小片段核酸分子，或者，待检测物是含有miRNA靶分子或具有3’ -OH其它小片段核酸分子的各种生物样本；DNA聚合酶；识别上游引物和下游引物缺口剂识别序列的缺口剂；三磷酸脱氧核苷酸；满足上述DNA聚合酶和缺口剂生物学活性功能的离子与缓冲体系；通过检测固相芯片固定引物释放的可检测信号实现多种靶分子的高通量定性和/或定量检测。
[0052]名词解释:
[0053]“衍生核苷酸(derivatized nucleotide) ”是指天然核苷酸之外的其它类型核苷酸。
[0054]“非特异性扩增”是指非靶分子导致的扩增。
[0055]“靶分子”是指采用本发明所述方法直接或间接检测的物质。
[0056]“寡核苷酸(oligonucleotide, 0DN) ”是指小分子核酸，由核苷酸残基(片段)通过磷酸二酯键(phosphodiester)或其它化学键(如:硫代磷酸酯键(phosphoroth1ates)连接或聚合而成，分子量介于核酸与核苷酸之间，并倾向于核苷酸。本发明对核苷酸残基的数目并无严格界限。
[0057]“新生DNA链”是指引物在DNA聚合酶的作用下延伸合成的DNA分子。
[0058]“定性检测”是指检测核酸靶分子是否存在，或者检测靶分子是否存在于待检测物。
[0059]“定量检测”是指检测靶分子的浓度，或者检测待检测物中靶分子的浓度，例如，检测待检测物中靶分子的拷贝数。
[0060]“缺口 ”是指双链核酸分子的一条核酸分子链保持完整性